版纳微型猪近交系体细胞核移植胚胎早期死亡相关基因的筛选

版纳微型猪近交系是世界上第一个培育成功的大型哺乳动物近交系，对开展异种器官移植、疾病动物模型、转基因动物及功能基因研究等方面有着巨大的应用前景。本项目针对版纳微型猪近交系体细胞核移植过程中胚胎早期死亡的相关基因进行研究，采用基因芯片表达技术分析体细胞核移植过程中正常胚和死亡胚的基因表达谱，筛选差异表达的基因；根据差异表达的基因，采用real-time PCR和Western-blotting检测基因的表达水平，通过表达水平与胚胎死亡率的相关性分析，确定与胚胎早期死亡相关的关键功能基因，为揭示体细胞核移植胚胎早期死亡的分子机制奠定基础，最终为提高版纳微型猪近交系体细胞核移植的成功率提供科学依据和技术途径。

小型猪的解剖学和生理学更类似人类，且比一般猪体型小和便宜易于饲养。因此小型猪已经广泛应用于生物医学等领域。体细胞核移植和转基因技术是制备应用于包括生物医学和异种器官移植等领域小型猪模式动物的关键技术。猪体细胞核移植因克隆效率极低阻碍了在上述领域中的应用。本项目对版纳微型猪近交系体细胞核移植过程中胚胎早期死亡的相关基因进行了筛选，同时研究了版纳微型猪近交系不同供体细胞以及滇南小耳猪的克隆效率。结果如下：1、我们采用基因芯片分别检测了妊娠第23、26、34天正常克隆胚胎和死亡克隆胚胎的基因表达谱，比较了正常胚胎组织和死亡胚胎组织中表达量差异性基因，通过分析检测出3022个有差异已知基因，其中上调2977个（Ratio>2），下调45个（Ratio<0.5）；依据Pathway和Go功能对每个基因的P-values值及信号通路分析、基因间的相互作用和基因本体功能等进一步筛后，发现CASP3、 P53、CAPNS1、PIAP、CCND2、CDKN1B、PIK3C3、IGF2、H19共9个基因可能与胚胎早期生长发育相关；通过RT-PCR检测和验证这9个基因的表达水平，从中筛选出CDKN1B、H19、IGF2、PIK3C3和P53共5个基因为版纳微型猪近交系胚胎早期死亡的关键基因。2、以版纳微型猪近交系的胎儿、新生猪和成年猪的成纤维细胞作为供体，都获得克隆个体，妊娠率、分娩率以及获得的克隆猪头数分别为60.0%、60.0%、8，80.0%、20.0%、3，33.3%、33.3%、1；克隆效率胎儿最高，新生猪次之，成年猪最低，分别为0.65%、0.4%和0.1%。3、滇南小耳猪体细胞核移植10头代孕母猪妊娠率90%，分娩率66.7%，共获得了36头克隆猪，其中22头成活；在死亡的14头中，11头经检测后判断为难产引起的窒息死亡；有一头妊娠母猪出生了11头克隆猪；克隆效率为0.79%。4、发表学术论文6篇，其中在《Plos one》等刊物发表SCI论文2篇，中文核心期刊4篇；获得授权的发明专利1项，培养硕士研究生3人；项目成员1人晋升为教授，1人破格晋升为教授，1人晋升为高级实验师，1人入选“云南省中青年学术和技术带头人后备人才”。. 综上所述，项目组除完成了任务书规定的全部研究内容和预期目标外，还研究了版纳微型猪近交系不同供体细胞以及滇南小耳猪的克隆效率。