版纳微型猪近交系移植免疫排斥相关基因的数字化表达谱分析

版纳微型猪近交系是世界上第一个培育成功的大型哺乳动物近交系，在开展异种器官移植、疾病动物模型、转基因动物、基因修饰、基因敲除及功能基因研究等方面具有巨大的应用价值。本研究拟针对版纳微型猪近交系猪→人异种器官移植过程中与免疫排斥反应相关的新基因进行研究，通过采用数字基因表达谱方法进行高通量筛选基因，illumina测序，对测序结果评估，基因注释，EST比对，筛选并初步确定与免疫排斥反应相关的新基因。采用real-time PCR和Northern-blotting检测基因的表达水平，通过表达水平与免疫排斥反应的相关性分析，确定与排斥相关的关键功能基因，并进行多组织表达谱分析、功能预测和鉴定。为揭示异种移植中免疫排斥反应的相关研究奠定基础，也可为下一步进行基因修饰和基因敲除确定重要的目标靶基因，最终为提高版纳微型猪近交系在异种器官移植领域中的成功率提供科学依据。

版纳微型猪近交系（BMI）是世界上第一个培育成功的大型哺乳动物近交系，在开展异种器官移植、疾病动物模型、基因修饰、转基因、基因敲除研究等方面具有巨大的应用前景。本课题针对BMI猪→人异种器官移植过程中与免疫排斥反应相关的基因进行基础研究，利用数字基因表达谱、生物信息学、比较基因组学、定位候选克隆策略、差异表达和协同表达EST等方法筛选并初步确定与免疫排斥反应相关的基因。采用qPCR法检测基因的表达水平，通过表达水平与免疫排斥反应的相关性分析，确定与排斥相关的关键候选基因。.研究中筛选并已克隆了相关基因73个，通过qPCR方法检测了这些基因在30-40个组织中的mRNA表达水平，证明了不同基因在相同的组织中表达量不同，同一基因在不同的组织中表达量也具有明显差异，呈现强、中、弱、无等不同表达丰度，揭示不同基因在不同组织中行使的功能不同。进一步对基因编码的蛋白质进行了功能生物信息学分析，确定了蛋白质的分子量、等电点、保守结构域、二级结构、三级结构、信号肽、亚细胞定位、跨膜结构、疏水性、蛋白质磷酸化位点、亮氨酸富集的核输出信号、功能位点等12项重要指标，并对氨基酸序列进行了多物种比对分析和聚类分析，揭示了基因在不同物种中的保守程度以及和人的相似程度。73个基因均已获得GenBank数据库认证的登录号，这些基因序列的注释以及对其功能的初步研究可为深入研究这些基因的表达调控、功能鉴定等奠定分子生物学基础。.通过GenBank数据库大量比对结合功能生物信息学分析，最终确定了主要与猪→人异种移植免疫排斥相关的基因9个（ASGR1、B4GALNT2、CD80、CMAH、CPN10、ICAM-2、OXSR1、P65、ULBP1），进一步构建了目的基因和绿色荧光蛋白报告基因的融合真核表达载体，并将其转染PK15猪肾上皮细胞进行表达检测，并从蛋白水平进行了Western Blot验证。本研究建立了利用近缘物种基因序列以及拼接猪EST序列克隆BMI基因、利用qPCR技术检测BMI基因多组织mRNA表达水平及利用真核核表达系统和Western Blot印迹研究BMI基因功能的技术方法。本研究结果为异种移植中免疫排斥反应相关基因的功能研究奠定基础，也为下一步进行基因修饰和基因敲除确定重要目标靶基因，最终为提高版纳微型猪近交系在异种器官移植领域中的应用提供科学依据。