通过基因敲除（TALENs）和过表达技术验证版纳微型猪克隆胚早期死亡相关基因PIK3C3的功能

Phosphoinositide-3-kinase class 3 (PIK3C3) is one of the embryonic death-related genes by whole-genome expression profile chip analysis of previously studies. In this study we plan to verify functions of PIK3C3 by using TALENs and over-expression. First of all, TALENs and gene over-expression of eukaryotic expression vector were constructed, and fetal fibroblasts of Banna miniature pig transfected were used as donor cell of somatic cell nuclear transfer embryos, then constructed embryos were transplanted to surrogate gilts. Expressiong level on mRNA and portein of PIK3C3 and downstearm genes accociated were detected in constructed embryos and tissues of cloned piglet. Immunocytochemistry and immunohistochemistry analysis were perform on different stage of embryos. And signal path on PIK3C3 were also analysed to confirm the functions of PIK3C3 gene.The revealed function of PIK3C3 by somatic cell nuclear transfer embryo of Banna miniature pig inbred line will lay a basis foundation to reduce the mortality of somatic cell nuclear transfer embryos.

课题组前期研究通过全基因组表达谱芯片筛选到与胚胎死亡相关的基因PIK3C3，本研究拟通过TALENs和基因过表达技术验证PIK3C3基因在胚胎发育过程中的功能。分别构建TALENs和基因过表达真核表达载体；然后转染版纳微型猪近交系胎儿成纤维细胞，利用体细胞核移植技术构建克隆胚，将其移植到代孕母猪体内。利用real-time PCR和Western-blotting方法检测胚胎、胎儿以及初生仔猪的组织和器官上PIK3C3基因及其下游相关基因的mRNA和蛋白质的表达水平，通过免疫细胞化学和免疫组织化学方法测定这些基因在胚胎不同发育阶段的蛋白质表达量差异，分析PIK3C3基因及其下游基因的信号通路，验证PIK3C3基因功能。阐明PIK3C3基因在版纳微型猪近交系体细胞核移植胚胎发育中的作用，为减少猪体细胞核移植中胚胎的死亡率提供科学依据。

PIK3C3作为3-磷酸肌醇激酶家族成员，参与自噬及胚胎发育等生命活动。本项目在前期基因芯片检测结果的基础上，将基因敲除或转基因与体细胞核移植技术相结合，对PIK3C3影响体细胞核移植重构胚早期发育进行了初步研究。首先构建转PIK3C3基因真核表达载体pPIK-IRES2-AcGFP1-EN和PIK3C3基因TALENs敲除载体，经电穿孔法转染版纳微型猪胎儿成纤维细胞，极度稀释培养，使用PCR、酶切及测序等方法筛选PIK3C3基因过量表达或基因敲除的阳性细胞作为供体细胞，结合体细胞核移植构建重构胚。共获得6个携带目的基因的胎儿成纤维细胞系，重构胚体外培养7天收集单囊胚30枚，经鉴定全部表达转入的目的基因，将重构胚移植入代孕母猪体内，共获得5头克隆胎儿和4头克隆仔猪，经鉴定胎儿和新生猪全部为阳性。获得28个敲除PIK3C3基因的成纤维细胞系，其中27个为单敲，1个为双敲，选择双敲的成纤维细胞为供体进行克隆，体外培养7天收集单囊胚30枚，经鉴定其中29枚为敲除阳性，将重构胚移植入代孕母猪体内，未获得成活克隆猪。结果表明PIK3C3敲除的胚胎在妊娠早期死亡，不能够正常发育成个体，说明PIK3C3在原肠胚形成过程中对胚胎发育是必须的。本研究为探讨PIK3C3在体细胞核移植重构胚早期发育过程中引起胚胎致死的分子机制奠定了坚实的工作基础，也为进一步开展PIK3C3作用机制研究提供了重要的线索。发表标注本项目资助的英文文章8篇，其中SCI收录期刊文章6篇，累计影响因子16.381，单篇最高影响因子5.228；已受理发明专利4项，获得授权发明专利1项。培养硕士研究生11人，指导在读博士研究生6人、在读硕士研究生9人，2人晋升职称，项目主持人通过后备人才培养考核，成为云南省中青年学术和技术带头人，并为云南农业大学动物基因编辑和体细胞克隆技术省创新团队带头人。