内生放线菌等微生物促进红豆杉中紫杉醇及类似物积累的分子机制研究

Taxus spp. are rare tree species of economic importance anticancer drug industry in China because Paclitaxel isolated from Taxus is a first-line anti-cancer drug. Because of low content of Paclitaxel in Taxus, high demanding of paclitaxel in the anticancer drug market lead to deforestation of wild Taxus. Therefore it’s an urgent research area to increase the yield from Taxus. Previous study suggested that endophytic microbes could promote the accumulation of Paclitaxel and its analogues in suspension cells of Taxus chinensis. The molecular mechanism underlying how endophytes promoting host plants' secondary metabolites accumulation is unclear. In this study, we will analyze the transcriptome of the cambial meristematic cells (CMC) culture of Taxus chinensis to identify genes that encode key enzymes responsible for the significance increase of Paclitaxel and its analogues in its biosynthesis pathway using OMICS and LC-MS technology. The interaction between the promoters of the key enzyme genes with the up-regulated transcription factors will be determined. The substrates of the key enzymes will added into the cambial meristematic cells cultures to validate the capacity of promoting accumulation and further analyze the active chemical composition of endophytes elicitor. This would elucidate the molecular mechanism that endophytes promote paclitaxel accumulation in Taxus, which would shed light on the strategy to increase the production of effective component of the useful secondary metabolites in Taxus. It will be an important breakthrough for reasonable use of the Taxus resources.

红豆杉是我国重要的珍稀经济树种，紫杉醇是抗癌一线药物，由于红豆杉体内紫杉醇含量非常低，造成野生红豆杉资源乱砍滥伐严重，因此提高红豆杉体内紫杉醇含量一直是研究热点。前期研究发现内生菌可促进红豆杉悬浮细胞中紫杉醇及类似物的积累，但内生菌促进宿主红豆杉次生代谢物积累的分子机制尚不清楚。本项目拟以红豆杉为材料，采用组学技术、液质联用技术和干细胞技术等，分析转录组数据获得紫杉醇生物合成途径中上调明显的关键酶基因，基因步移法扩增获得关键基因启动子序列，研究启动子与上调表达的转录因子之间的相互作用，将上调表达的关键酶底物加入红豆杉干细胞体系中进行验证，同时研究内生菌诱导子中有诱导作用的化学成分，揭示内生放线菌等微生物促进红豆杉干细胞体系紫杉醇及类似物积累的的分子机制。本研究对解决红豆杉有效成分产量偏低，加快药用次生代谢产物生产等方面打下理论基础，同时对红豆杉资源的合理利用具有重要的理论意义。

红豆杉中的抗癌活性成分紫杉醇能够有效抑制癌细胞的增生繁殖，是治疗癌症的珍贵药物。但红豆杉生长缓慢，且紫杉醇含量极低，因此在不破坏野生森林资源的前体下，利用现代生物技术手段提高紫杉醇产量具有重要意义。我们利用可培养技术对从湖北利川星斗山自然保护区及云南腾冲县腾北园艺苗圃园的南方红豆杉和云南红豆杉样本中分离内生菌，获得63株内生真菌，138株内生细菌，并对内生菌的活性进行筛选，确定了活性菌株。以内生细菌产胞外多糖能力大小为筛选指标，筛选出一株产糖量达到616.0mg/L，且在终浓度为200mg/L的多糖浓度诱导下，红豆杉干细胞提取物内的紫杉烷类的活性化合物的相对含量提高。多糖结构初步表征结果显示此多糖为均一组分多糖，分子量大小为71.3kDa，由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖醛酸及木糖等七种单糖组成，是主要由(1→4)糖苷键连接葡萄糖残基组成的，并在其6位处连接有分支结构的具有吡喃基团的α-型葡聚糖。将分离得到内生真菌制备成诱导子，对南方红豆杉苗进行侵染筛选，结果有一株真菌诱导的南方红豆杉苗叶片中，10-DAB和巴卡亭Ⅲ的含量分别降低了70.64%和86.17%，紫杉醇含量升高了286%。说明该菌株可促进紫杉醇生物合成中的中间代谢产物向终产物的转化。对分离到的内生细菌进行诱导筛选，获得一株可提高红豆杉干细胞中紫杉醇积累的内生细菌。对处理和未处理的红豆杉针叶及干细胞进行转录组测序，获得了一系列受调控的转录因子。对这些转录因子进行分析并转入红豆杉干细胞中，部分可以提高红豆杉干细胞中紫杉醇含量。其中转TcMYB29a基因的红豆杉干细胞中紫杉烷含量增加最多。qRT-PCR结果表明转基因红豆杉干细胞中紫杉醇合成途径中的大部分基因都上调表达，ChIP，Y1H，EMSAs和LUC结果表明MYB29调控T5OH的表达。组织表达模式分析显示，TcMYB29a在红豆杉针叶和根中高表达。对TcMYB29a的启动子分析及实验结果显示TcMYB29a受ABA调控。该结果可为后续利用生物技术提高紫杉醇含量提供理论支撑。