内生放线菌提高银杏抗叶枯病的途径与机制探索

Gingko biloba rarely infected by pathogens. However,the leaf blight pathogenic fungi of ginkgo have caused great influence for the growth and related products of ginkgo in recent years. The study of endophytic actinomyces have become a research hot spot on biocontrol of plant fungal disease.We found there were less endophytic actinomyces in the ginkgo tree infected leaf blight pathogenic fungi than that of healthy gingko trees in the preliminary research work. The research work of Ginkgo biloba will be carried out as follow:The analysis for the endophytic actinomyces of diversity variation in the healthy and infected ginkgo. determination of coconisation status in the gingko tree by antibiotic mark positioning active actinomyces, detection of active constituents, the enzyme activity of resistance related defense and the change of the ginkgolides phenolic acids in the gingko and the actinomyces. Meanwhile, we used many methods to explore the ways and mechanism how to improve the ginkgo anti-leaf blight disease. Those methods including that the morphology, environmental scanning electron microscopy (SEM) characteristics, mRNA ddrt-pcr ect molecular biology technology and analysis of the chemical composition of the ginkgo by using the technology of mass spectrometer platform metabonomics. search of the anti-pathogenic fungi peptides produced by inoculation of the endophytic actinomyces through the technology of 2-DEDIGE-MALDI-TOF/TOF. This study could provide the theory basis for the biocontrol of ginkgo leaf blight disease.

银杏很少发病，但是近年来银杏叶枯病对银杏的生长及相关产品造成了很大的影响。内生放线菌已成为植物真菌病害生物防治研究热点。本课题组在前期分离银杏内生放线菌时，发现有叶枯病的银杏内生放线菌较少，本课题以银杏为研究对象，通过对银杏叶中内生放线菌的多样性差异分析；采用抗生素标记定位活性菌在植株体内定殖状况；并从抗病活性物质的产生、银杏抗病相关防御酶活、内生放线菌对银杏内酚酸类物质的变化等生理生化指标方面进行分析；并通过形态学、环境扫描电镜特征、mRNA差异显示等分子生物学技术；同时运用多质谱平台代谢组学技术对回接生防菌的银杏植株化学成分进行分析，运用二维差异凝胶电泳( 2-DEDIGE )和MALDI-TOF /TOF串联质谱差异蛋白质组学方法寻找植物在内生菌作用下产生的抗菌肽。探索内生放线菌提高银杏抗叶枯病的途径和机制。为银杏叶枯病的生物防治提供理论依据和基础。

本项目以银杏为研究材料，对其内生菌多样性进行研究。利用可培养技术对从徐州等银杏产区银杏样本中分离内生菌，通过去重复，共获得140株内生真菌，156株内生放线菌，利用相关分子生物学技术对其进行了系统归类和鉴定。对获得的1株银杏叶枯病病原真菌Alternaria alternate klbmp01234为研究对象进行抗病研究。利用获得的内生菌对植物病原菌进行活性筛选、最终确定了可以抑制叶枯病病原菌生长活性的活性内生菌株。利用高通量筛选技术对江苏地区不同银杏产区的银杏内生菌多样性进行了研究，发现了内生菌在银杏次级代谢产物积累方面的相关性。利用色谱分离技术对活性菌株中的活性成分进行了分离、鉴定了7个活性化合物。同时从不发病的银杏品种中分离获得一脂溶性多糖为主要活性成分，经过试验表明，该脂溶性多糖可以有效的抑制银杏叶枯病病原菌的生长，主要由鼠李糖、木糖构成，通过色谱鉴定，该多糖结构主要为一直链多糖，其构型主要为（1→3）-Rha-（1→4）-Xyl，分子量为8790，通过质谱技术对单糖的连接顺序进行了确认，同时红外光谱数据表明其端头碳原子构型为α和β构型。同时我们建立了银杏组培苗的培养方法，利用银杏组培苗研究银杏内生菌提高银杏拮抗病菌的机制，结果表明接种银杏内生菌的银杏组培苗中各类重要活性酶，如过氧化酶、超氧化物歧化酶等都有了显著了变化，而这些显著的变化对提高银杏抵抗病原菌具有重要的意义。通过项目的实施，我们积累了大量的银杏内生菌资源，其中具有多种活性（抗氧化、抗肿瘤、抗菌）的内生菌占到了50%以上，为今后进一步开发林业内生菌资源奠定了重要的物质基础。项目实施期间，共发表论文19篇，其中SCI论文8篇，培养研究生5人。