杨树内生放线菌抗杨树黑斑病菌活性成分及其作用机理研究

杨树黑斑病菌对杨树造成很大的危害，植物内生放线菌防治植物病害是近年来研究热点，已成为植物病害生物防治一类极具应用潜能的新资源。本课题组已从杨树中分离500余株内生放线菌，通过前期的实验筛选，内生放线菌2284菌株对杨树黑斑病病菌有很好的抑菌活性。本课题以杨树黑斑病菌为主要研究对象，在生物活性跟踪的指导下进行抗杨树黑斑病病菌活性研究。拟应用组合技术即将传统的天然产物分离技术与微生物活性筛选结合一起确定代谢产物活性指纹区域，利用色谱及光谱技术分析代谢物质类型，采用有机溶剂萃取、高速逆流色谱和制备液相色谱等方法提取分离内生放线菌发酵液和菌丝体中的代谢活性物质，采用波谱学技术鉴定活性单体化合物3-5个，并通过形态学、电镜表征、组织细胞学、分子生物学、症状学和生理生化指标等研究，探索活性化合物抗杨树黑斑病菌作用机理。为杨树黑斑病病菌的生物防治提供理论依据和应用基础。

本项目以杨树为研究对象，从杨树中共分离得到441株内生放线菌，对其进行培养特征，形态特征的观察，结果表明，杨树内生放线菌主要以链霉菌属为优势类群，一共分布在11个链霉菌属类群中，其中94株为灰褐类群，55株为白孢类群；65株为黄色类群；36株为粉红孢类群；44株为烬灰类群；45株为灰红紫类群；44株为金色类群，其余的为淡紫灰类群（2株）、青色类群（5株）、蓝色类群（2株）和吸水类群（1株）。对部分菌株进行16S rRNA测序以及序列分析发现它们分属于链霉菌属（Streptomyces）、糖丝菌属（Saccharothrix）、戈登氏菌属（Gordonia）、拟诺卡氏菌属（Nocardiopsis）、糖多孢菌属（Saccharopolyspora）以及冢村氏菌属（Tsukamurella）等6个属。.对从杨树等树木中分离出的600余株内生放线菌进行了抑制杨树病原真菌活性筛选。结果显示：有200余株内生放线菌对杨树黑斑菌菌3个菌株Marssonina brunnea YH1、YH2和YH3具有较好的抑菌活性，其中，内生放线菌KLBMP2170菌株活性最强。.以杨树黑斑病病原真菌Marssonina brunnea 为供试病原菌，以KLBMP 2170 活性物提取物抑菌率为指标，进行KLBMP 2170培养基优化和发酵条件优化。研究结果证明KLBMP 2170活性物提取物对光照、紫外线的稳定性较好，但在pH<5，温度大于120℃时稳定性有所下降。.对KLBMP 2170乙酸乙酯相进行GC-MS分析，鉴定了19个化合物，其中苯乙酸、丁香酚和丁位十二内酯具有抑菌活性。利用LC-MS分析鉴定了三个活性化合物：RS-22A、Scopafungin、Spirofungin。利用活性跟踪分离得到三个活性化合物：穗花杉双黄酮、球毛壳菌素 F、sclerotioramine。.通过体内、体外实验表明，菌株KLBMP 2170的活性代谢产物能裂解杨树黑斑病病原真菌的细胞壁，导致菌体空间结构塌陷，并且对细胞膜系统的完整性造成影响，致使菌体胞内内含物外渗，胞内蛋白含量减少，导致细胞死亡。根据杨树叶片石蜡切片的对比照片表明无论在离体还是活体条件下KLBMP 2170代谢产物对杨树病原菌均有抑制作用。