内生真菌促进濒危植物八角莲中鬼臼毒素积累的机制研究

Dysosma versipellis as a source for podophyllotoxin is an endemic plant in China. With the wide use of podophyllotoxin, the plant have been over-harvested and been facing a high risk of extinction due to almost exhausted wild resource. At present time, production of podophyllotoxin in suspension cultured cells of D. versipellis proves to be effective to solve the problem mentioned above. However, this method is limited by such issues as low-content active-ingredient, unclear mechanism of podophyllotoxin biosynthesis, etc. A new method is rising that production of podophyllotoxin can be enhanced by the inductive effect of co-culture of endophytic fungi and its host. In this project, endophytic fungi will be isolated from rhizomes and roots of wild D. versipellis, and suspension cultured cells will be developed using foliar callus from D. versipellis. The endophytic fungi and suspension cultured cells will be co-cultured to investigate the effect of fungal elicitor on podophyllotoxin biosynthesis in suspension cultured cells from D.versipellis. Methods in molecular biology, biochemisty and plant secondary metabology will be used to study the effect of fungal elicitor on the process of podophyllotoxin accumulation and reveal the expression patterns of the enzymatic genes responsible for the podophyllotoxin biosynthesis. The outcome of this project will have very important academic and practical significance for explanation of mechenism of podophyllotoxin biosynthesis induced by fungal elicitor and rapid production of podophyllotoxin.

八角莲是我国鬼臼毒素来源的特有植物。由于鬼臼毒素的广泛使用，致其宿主植物过度采挖，野生资源几近枯竭，物种濒危。采用八角莲植物细胞悬浮培养获得鬼臼毒素是解决上述问题的可行方法，然而，这一技术仍然面临着有效成分含量偏低、鬼臼毒素产生机制不清楚等严重问题。采用内生真菌与宿主植物细胞共培养，进而诱导鬼臼毒素的积累，是解决这一问题新兴而有效的途径。本项目从野生八角莲植物的根和茎中获得内生真菌，并以叶愈伤组织建立以八角莲细胞悬浮培养体系，采用真菌与悬浮细胞共培养体系，研究真菌诱导子对八角莲悬浮细胞积累鬼臼毒素的影响规律，采用分子生物学、生物化学及植物代谢组学的研究方法，研究内生真菌诱导子诱导鬼臼毒素积累的代谢过程，揭示促进鬼臼毒素合成的关键酶基因表达机制。这对阐明内生真菌诱导鬼臼毒素积累机制、快速生产鬼臼毒素具有重要的理沦和实践意义。

针对我国特有濒危植物八角莲组织培养过程中鬼臼毒素含量偏低的问题，探索内生真菌对鬼臼毒素累积的影响。通过研究，本项目获得了广西永福县野生八角莲植物内生真菌224株，经鉴定合并后获得形态型菌株53株，阐明了它们之间的遗传多样性和生物活性多样性，其中10株真菌具有抗菌活性，8株真菌具有抗IN-LEDGF/p75相互作用的活性；研究了八角莲菌根的形态特征；摸索出了从野生八角莲植株获取无菌外植体的方法，建立了八角莲愈伤组织培养体系和离体根悬浮培养体系，并用HPLC研究了八角莲根、根茎、叶和叶柄中的鬼臼毒素含量。在此基础上，试验了53株内生真菌诱导子对八角莲鬼臼毒素累积的影响，其中13种真菌诱导子对鬼臼毒素累积具有促进作用，其余真菌诱导子具有抑制作用或作用效果不明显。以Z.syzygii（WB5143）和F.solani（WB5122）真菌诱导子试验了对八角莲愈伤组织和离体根悬浮培养的影响规律，结果显示，不同种属的真菌诱导子对鬼臼毒素累积的作用效果存在差异；混合两种真菌诱导子的作用效果要差于单一真菌诱导子的作用效果。真菌诱导子作用的分子机制研究表明，悬浮培养72小时，Z.syzygii真菌诱导子能够激发细胞中NO信号分子的迸发，NO的含量为对照组的0.576倍，同时显著提高了苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）的活力，显著促进鬼臼毒素合成代谢途径中关键酶基因的正向上调表达，其中丙氨酸氨基裂合酶基因（PAL）和肉桂醇脱氢酶基因（CAD）的基因表达分别比对照组正向上调2.24倍和9.94倍。HPLC和LC-MS的检测结果显示，接种Z.syzygii真菌诱导子诱导八角莲愈伤组织和离体根中活性成分鬼臼毒素的累积量最高分别为对照组的3.51倍和1.75倍。研究结果有助于濒危药用植物八角莲的迁地保护及其资源的可持续利用，这对于将来应用内生真菌与药用植物相互作用的天然共生关系生产鬼臼毒素具有重要的生物学意义和应用前景。受本项目的资助，部分研究成果已被Scientific Reports、中国药学杂志和中国中药杂志等杂志接收发表；部分研究内容已获国家发明专利授权3项；已发布广西地方标准1项。