犬钩虫中Caenorhabditis elegans daf同源基因的鉴定和功能研究

钩虫等重要寄生线虫的L3感染期幼虫在感染人和动物前会发生滞育，目前这种机制还不清楚。daf是C.elegans dauer形成中所必须的基因,在C.elegans 发育过程中幼虫在不利环境下会形成Dauer幼虫存活很长时间直到度过不利状况。Dauer形成主要是由胰岛素IGF-1和TGF-?信号通路控制，一系列Daf基因是组成这两条通路的成分。目前认为寄生线虫的感染期幼虫与Dauer类似，但是否在寄生线虫中存在daf基因并控制感染期幼虫形成还不清楚。本课题应用C.elegans的研究结果来探讨daf同源基因在犬钩虫体内的功能。通过基因克隆、表达和免疫荧光抗体染色研究daf同源基因在犬钩虫不同发育时期的表达和分布；利用RNA干扰研究其功能；探讨daf同源基因在犬钩虫和感染期幼虫中的作用。本课题可以为寄生线虫基因结构和功能的研究提供重要信息，并为以幼虫为靶目标的寄生线虫防治提供有价值的理论成果。

钩虫(hookworm)是重要的人兽共患寄生虫。感染期幼虫是钩虫从自由生活向寄生生活的过渡，也是完成寄生生活的必须阶段。钩虫L3幼虫类似C.elegans的dauer期，停止取食，发育停滞，体壁加厚能抵抗外界环境变化，直到遇到宿主重新摄食和发育。本项目通过对犬钩虫四个daf基因的研究，阐明了犬钩虫daf-1、daf-12、daf-21和daf-19在犬钩虫发育的不同阶段的表达情况以及功能。Daf-1基因编码一个TGF-β I型受体蛋白，参与细胞增殖、分化、凋亡、细胞转移、胚胎发育，钩虫中对该信号通路研究的比较少。我们克隆得到了犬钩虫daf-1基因的cDNA序列，该基因编码一个590个氨基酸的跨膜蛋白。诱导表达得到58kDa的重组蛋白。Real Time PCR显示犬钩虫成虫中daf-1表达量远高于幼虫阶段，L1幼虫表达量最低。免疫荧光检测DAF-1在幼虫食道腺，咽以及肠道细胞质中表达丰富，在成虫体壁有强烈表达。为了解犬钩虫中DAF-12、DAF-19、DAF-21的功能，我们对犬钩虫的daf-12B、daf-19、daf-21基因进行了克隆和表达鉴定。克隆构建DAF-12、DAF-19、DAF-21的cDNA原核表达载体，诱导表达得到DAF-12、DAF-19、DAF-21的重组蛋白。纯化后免疫动物获得相应抗体。Western Blot 检测了这些蛋白在L3、雌虫时期的表达情况，表明这些蛋白在L3和雌虫中均表达。Real-time PCR显示daf-12B的转录发生在犬钩虫的L1/L2、L3以及雌虫和雄虫阶段，成虫阶段表达量较高,其中雄虫表达量最高；daf-19的mRNA在L3期表达量最高；daf-21的mRNA转录在成虫阶段表达量非常之高，L3期幼虫中含量很少，在L1/L2期幼虫中表达量最低。免疫荧光染色发现这四种基因在犬钩虫成虫和不同发育时期均有表达。DAF-12B在犬钩虫L1/L2期中幼虫头部，特别是食道球中的荧光强烈，DAF-12B分布在L3期整个虫体中，切片显示DAF-12B分布在成虫皮层、卵巢等部位。DAF-19分布在虫卵细胞质中、L1/L2期肠道处和L3期食道腺、肠道细胞胞质和尾部。DAF-19在成虫体腔壁、肠壁、卵巢、卵壁及卵内都有分布。DAF-21分布在虫卵、L1/L2期的表皮处、L3期前部食道和肠道以及成虫体腔壁、肠壁等处有广泛的分布。