锌指蛋白核酸内切酶在HIV感染细胞及潜伏细胞上介导整合HIV前病毒DNA有效切除

HIV-infected individuals currently cannot be completely cured because existing antiviral therapy cannot specifically delete the integrated HIV proviral DNA and the latently infected cells establish a stable reservoir which cannot be easily eradicated. To solve this key scientific challenge, we propose here in this project a new strategy that can treat the disease at the root cause by using specially designed zinc-finger nucleases (ZFN) to remove integrated HIV provirus, flanked by long terminal repeats (LTRs). Using an LTR sequence highly conserved in all HIV-1 subtypes, we commercially designed and screened out one ZFN pair, named ZFN-LTR, which can specifically target HIV-1 provirus LTR with high efficiency in yeast MEL-1 reporter assay . Transfecting ZFN-LTR and control plasmids into the HIV-1 infected or latently infected cell models we've established, we will detect the effectiveness of ZFN-LTR by flow cytometry after treat the cells with ZFN-LTR; and we will further verify the removal of integrated HIV proviral DNA by sequence analysis and explore the mechanism of DNA repair. To address the antiretroviral activity of ZFN-LTR, we will measure the copy number of HIV-1-encoded gag gene by quantitative real-time PCR and the expression level of P24 protein by ELISA. On the other hand, we will analyze the cytotoxicity and genotoxicity of ZFN-LTR to assay its safety. Through the above research, this project aim is to get one ZFN pair that can specifically and effectively mediate HIV proviral gene deletion, exploring a new method for effective removal of the integrated virus, and opening a new avenue to the complete cure for HIV.

目前，艾滋病不能完全被治愈的原因不仅与其"治标不治本"的治疗方法有关，而且也与HIV前病毒整合后潜伏有关。针对这一关键科学问题，本申请项目提出了锌指蛋白核酸内切酶（ZFN）介导整合HIV前病毒切除的"斩草除根"的策略；拟以已经建立的HIV感染细胞或潜伏感染细胞为靶细胞，以在HIV-1各亚型中高度保守的LTR序列为特异靶点，设计并筛选出了一对靶向切除率较高的ZFN-LTR；将ZFN-LTR及其对照载体分别转入靶细胞，检测分析靶细胞前病毒基因缺失的效率，利用DNA序列分析方法进一步证实HIV前病毒基因的缺失，探讨DNA修复的分子机制；利用定量PCR及ELISA方法，检测分析其抗病毒活性；检测分析细胞毒性和基因毒性，评价ZFN-LTR的 安全性。通过上述研究，旨在获得具有靶向性和有效性于一体的介导HIV前病毒基因缺失的ZFN-LTR，探索出有效清除整合病毒的新方法，为HIV彻底治愈开辟新途径。

艾滋病是由人类免疫缺陷病毒（HIV）感染而导致的一种传染性疾病。尽管，高效抗逆转录病毒治疗能显著改善HIV感染者的生存率，但该疗法并不能完全治愈病人，其重要原因是目前抗病毒药物仅能抑制HIV-1病毒的复制，并不能对感染的免疫细胞基因组中已整合的HIV前病毒DNA起作用。而整合的HIV前病毒DNA，不仅在感染细胞中被作为病毒基因转录的模板，而且，在潜伏感染细胞中也是病毒长期潜伏的基础以及病人停药后病毒再次反弹的根源。因此，如何靶向的清除整合在宿主靶细胞染色体上的HIV前病毒是目前HIV/AIDS治疗研究领域最富有挑战性的科学问题；倘若能使整合的HIV前病毒从宿主靶细胞基因组上缺失，那么，则可从根本上解决HIV/AIDS不能治愈的问题，实现“斩草除根”的梦想。基于基因编辑技术,我们在国际上首次设计并获得了一对能特异靶向多数HIV亚型基因保守区LTR的ZFN-LTR，在多个HIV感染及潜伏细胞系上证实了ZFN-LTR能特异靶向HIV-1前病毒LTR并介导整合的全长HIV-1前病毒的高效切除，切除效率达45.9% , 获得了显著抗HIV感染的效果,且对细胞周期及增殖未见影响, 与对照在体相比也未见脱靶现象, 提示该方法将可能为一个可选择的根除HIV的治疗手段,该文发表在国际著名杂志.（Nucleic Acids Res，2013;41(16):7771-82, SCI IF= 9.23）。同时, 我们筛选并获得到了可有效地切除整合的全长HIV-1前病毒DNA的另外一对锌指核酸内切酶ZFN-LTR，并在HIV感染细胞及潜伏感染细胞证实了其有效性和可用性(Mol Biol Rep, 2014 Sep;41(9):5819-27).另外,利用基因编辑技术, 我们获得了能特异靶向HIV调控区的锌指转录因子（ＺＦＰ）及转录样因子（ＴＡＬＥ）融合基因，并在潜伏细胞模型上证实了这些融合蛋白可靶向激活潜伏HIV表达（Gene Therapy ，2014，21，90-95；AIDS Res Hum Retroviruses，2015，31:98-106）, 提示了该方法有可能成为一个可选择的抗HIV潜伏治疗手段。