T1DM免疫调节肽P277功能优化及诱发AS副作用的逆向调控

Atherosclerosis is a major complication of diabetes. Thus, end stage diabetic patients require a vaccine therapy that will not only treat their type I diabetes but also treat atherosclerosis. P277 (trade name DiaPep277) is a vaccine used to treat type I diabetes and is currently tested in phase III clinical trial. We have read and confirmed that heat shock protein 65 (Hsp65) can cure atherosclerosis. Our team has produced a construct using linear repeats of the P277 peptide fused to the C-terminal region of HSP65 that should cure both atherosclerosis and type I diabetes. However, we found that when the construct is administered by nasal, vascular endothelial cells are injured and atherosclerosis is induced. We tested different regions of the P277 peptide and found that the B epitope （N-Terminal）induces atherosclerosis. The purpose of this project is to artificially regulate the P277 peptide by replacing the atherosclerosis-causing B epitope with a mutant that will not cause atherosclerosis nor reduce the ability to cure type I diabetes. Based on this new construct, we should be able to make P277 a more effective medicine by enhancing its effectiveness in controlling diabetes and eliminating the induction of atherosclerosis.

动脉粥样硬化是糖尿病的重要并发症和致死原因。具有抗动脉粥样硬化和抗糖尿病双功能蛋白将成为理想的抗糖尿病药物。我们在一项结题的国家自然科学青年基金项目中，尝试对HSP65 分子进行定向改造，保留其抗动脉粥样硬化功效、强化其抗糖尿病功效。我们将P277肽重复串联并融合于HSP65羧基端构建的融合蛋白HSP65-6×P277经粘膜免疫NOD小鼠时，可减轻1型糖尿病的临床症状, 且效果优于单独使用P277。但在后续研究中发现HSP65-6×P277经粘膜却能诱发动脉粥样硬化。经进一步研究发现诱发动脉粥样硬化的毒性表位为P277肽N端的B表位。本申请旨在遴选安全表位，通过表位替换的方式，构建新型P277肽疫苗。在优化P277肽原有抗糖尿病作用的同时，消除其诱发动脉粥样硬化的副作用。

1型糖尿病（TIDM）是由于胰岛β细胞的分泌能力受到破坏而引起机体丧失调节血糖能力的一种自身免疫性疾病。热休克蛋白60（Hsp60）是胰岛β细胞的主要自身抗原之一，其上一段特异性多肽（P277）是与效应T细胞反应的抗原决定簇。目前已有临床试验证明皮下注射P277能预防和治疗1型糖尿病，同时也有动物实验证明其B表位也会诱发动脉粥样硬化（AS）。.通过P277肽内部功能性肽段的分子解析，探明了P277肽分子内部治疗糖尿病的分子表位P2，接着遴选了三个辅助性B表位，替换P277肽段中B表位。实验证明用IA-2的B表位替换P277肽段中诱发动脉粥样硬化的B表位的新疫苗肽IA-2-P2能够有效的降低NOD小鼠糖尿病的发病率。.由于多肽IA2P2分子质量小，免疫原性差，通过与热休克蛋白(Hsp65) 串联增大其免疫原性。首先将IA2P2 肽段重复6次融合在Hsp65 载体的C 端，再将6个串联的His 标签连在Hsp65的N端，构成稳定的融合蛋白。通过小鼠鼻黏膜免疫，发现His-Hsp65-6IA2P2组NOD小鼠终末血糖值明显降低，胰岛炎程度明显减轻，胰岛素分泌量明显升高，体重维持较正常，可以明显降低NOD小鼠糖尿病发病率，同时也明显延长了NOD小鼠的生存时间，且效果优于阳性对照组。.同时我们对P277肽进行表位扫描，通过多肽免疫BALB/c小鼠，ELISA测定P277抗体水平确定B表位所在，通过替换为丙氨酸和删除获得两条改造肽AP和VP。改造肽皮下注射BALB/c小鼠后，测定抗体与人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的结合能力以及细胞毒性。同时，皮下免疫NOD/LtJ小鼠，探究改造肽AP/VP对T1DM的预防作用及作用机制。并免疫高脂或普通饲养的新西兰大白兔，判定其动脉粥样硬化发病程度。 结果显示，相较PBS和AP，VP和P277组能够更好的维持血糖、保持体重，降低发病率和死亡率，且VP多肽药效比P277多肽组更优。.在此本课题的支持下，目前已发表并标注本基金资助和项目号的研究论文共计16篇，其中SCI论文共计5篇，累计影响因子超过13；共申请专利6项，其中2项已授权；共培养硕士生5名。