抗MERS-CoV新型抗体-多肽双特异性免疫治疗剂的构建及其抑制病毒感染的效果研究

Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus（MERS-CoV）is a novel coronavirus which can cause severe acute respiratory illness with a high mortality rate. The outbreak of MERS-CoV poses a serious threat to global public health and highlights an urgent need for the development of effective therapeutic and prophylactic agents to treat and prevent MERS-CoV infection. Our lab has previously developed some exceptionally potent fully human monoclonal antibodies (mAbs) and inhibitory peptides against MERS-CoV. In the current application, we plan to generate the fusion proteins of mAbs and peptides, and to develop them as more effective bispecific immunotherapeutics compared to mAbs or peptides alone. We would also investigate their mechanism of actions which could provide future directions towards the development of antibody-based antivirals and vaccine design.

中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus, MERS-CoV)是继SARS冠状病毒(SARS-CoV)之后发现的一种能引起人严重急性呼吸道疾病,具有高致死率的新型冠状病毒。MERS爆发对全球公共卫生构成了严重威胁，到目前为止，还没有针对MERS-CoV的疫苗或特异性防治药物，因此迫切需要开发一种有效的抗病毒药物来对抗这一新兴的全球性威胁。本课题拟在实验室前期已经筛选出高活性MERS-CoV全人源中和抗体、高活性MERS-CoV抑制多肽的坚实基础上，构建一种抗体与抗病毒多肽的融合蛋白，以期将融合蛋白开拓为一种比抗体、抗病毒多肽效果更好的新型双特异性高效免疫治疗剂。同时，分析融合蛋白的作用机理，为研制新型抗病毒药物及疫苗提供新思路。

本课题围绕超高活性全人源中和抗体、高活性抑制多肽融合蛋白所产生的新型双特异性免疫治疗剂是否具有更高抗MERS冠状病毒活性这个关键科学问题开展研究，顺利地完成了课题，获得了一些重要的结果。目前，共发表标注项目号的SCI论文5篇，其中第一或共一作者SCI论文5篇。申请国家专利1项。在论文及专利方面完成课题预期的指标。.按照课题研究计划，在前期开发出超高活性全人源中和抗体、高活性抑制多肽的基础上，构建一种由抗病毒小分子单链抗体（m336 scFv）与抗病毒多肽（HR2P）构成的双特异性融合蛋白（m336 scFv-HR2P）。通过进一步检测融合蛋白抑制MERS-CoV感染的效果，并与单独使用抗体或抗病毒多肽的效果进行比较，以期将融合蛋白开拓为一种比抗体、抗病毒多肽效果更好的新型双特异性高效免疫治疗剂。我们获得了CH3- pep, m336 scFv, m336 scFv-HR2P and diabody- pep四种融合蛋白。利用ELISA、表面等离子共振等技术，比较融合蛋白、m336 scFv、HR2P与MERS-CoV S蛋白以及蛋白突变体的结合性能，表明平衡常数最小、亲和力最强的是scFv-HR2P。通过病毒中和活性测试发现m336 scFv、scFv-HR2P、diabody-pep均具有显著的抑制活性，其中，中和活性最高的是scFv-HR2P。而细胞融合（cell-cell fusion）试验通过将不同浓度梯度CH3-pep、m336 scFv、scFv-HR2P、diabody-pep与效应细胞混合，加入靶细胞Huh-7中培养。得出细胞融合抑制率最高的是diabody-pep。通过结果分析，两种融合蛋白抑制病毒的能力在不同方面得到了提升；抗病毒活性与其结合病毒S蛋白的活性一致，而细胞融合试验diabody-pep活性更强一些，可能diabody-pep含有两条单链抗体和两条多肽，体积较大，能够利用其位阻效应更好地抑制靶细胞与效应细胞的融合。.综上所述，该结果提供了抗体-多肽双特异性融合蛋白作为一种比抗体、抗病毒多肽效果更好的新型高效免疫治疗剂的可行性，为开发更加经济、高效的抗MERS防治药物提供理论基础和解决方案。