抗IL-4、IL-33新型双特异性抗体的构建及其对哮喘气道炎症的影响

哮喘是一种慢性气道炎症性疾病，TH1/TH2细胞因子平衡偏移在哮喘发病机制中占主导地位。IL-4和IL-33在调节TH0细胞分化为TH2细胞及放大TH2型细胞介导的过敏性炎症方面起着致关重要的作用。本研究前期工作构建了天然人源大库容量抗体文库，拟采用已建立的核糖体展示和生物大分子相互作用技术从文库中筛选抗IL-4和抗IL-33单链抗体，并对其进行亲和力进化和提高。然后采用基因重组技术将它们与人源IgG的CH2-CH3融合，在哺乳动物细胞中高效表达，制备稳定、高亲和力、半衰期长并可同时中和IL-4和IL-33生物学活性的人源双特异性IgG型(IgG-like)四价抗体，明确其在构建的小鼠哮喘模型中对哮喘炎症的抑制作用，为阐明IL-4、IL-33在炎症性疾病中的作用提供新依据。该研究是对哮喘免疫防治新策略的探索，可为炎症性疾病的免疫防治提供新思路，具有重要的理论和实用价值。

在国家自然科学青年基金的资助下，采用了改进的文库构建方法重新构建了大库容量多样性良好的天然全人源抗体文库，其文库容量达到了1.2×10E+8，指纹图谱和测序分析结果显示构建的全人源抗体文库多样性好。成功的克隆表达了人IL-4和IL-33，表达的IL-4 融合蛋白大小为26 kDa左右；IL-33融合蛋白大小为45 kDa左右，Western blot 鉴定显示表达的蛋白正确，分别为IL-4和IL-33目的蛋白。应用表达的蛋白采用噬菌体展示技术对抗体文库进行了3轮富集，从3轮富集后的文库中挑取单克隆子进行小量表达及ELISA筛选，结果显示有30%左右的克隆子显示阳性。Biacore分析筛选到的抗IL-4和IL-33 单链抗体，其亲和力达到了1×10E-8。为提高单链抗体的亲和力，采用易错PCR技术和DNA改组技术分别构建了抗IL-4及抗IL-33突变抗体文库，对筛选的抗IL-4和抗IL-33单链抗体进行了亲和力进化，其亲和力达到了1×10E-10左右，采用ELISA、Western blot及测序验证了单链抗体的生物学性能。根据筛选进化的抗IL-4和抗IL-33单链抗体分别构建信号肽（SP）- VH4-linker-VL13-Fc/pcDNA3.1-Neo（+）重组载体，插入的重组基因SP-VH4-linker-VL13-Fc 大小为1.6 kb左右。构建了SP-VH4-linker-VL13/pcDNA3.1-Hyg（+）重组载体，插入的重组基因SP-VH4-linker-VL13大小为800 bp左右。将上述两个重组载体共转染CHO细胞，得到抗IL-4、 IL-33 双特异性抗体。用OVA致敏BALB/C小鼠，建立小鼠哮喘模型，设立对照组，用构建的双特异性抗体治疗小鼠哮喘模型，结果显示双特异性抗体治疗后能明显改善小鼠的气道高反应性及IgE的产生，减少Th2 细胞因子，其影响作用及机制后续还会进一步深入研究。