利用CRISPR/Cas9系统对调控基因转录的顺式元件及反式因子的高通量筛选和鉴定

For functional genome study, an efficient method for high-throughput identifying all kinds of transcripition factors or DNA binding proteins involved in gene regulation is absent, developing such a strategy is necessary.CRISPR/Cas9 system has the advantage of being targeting specific and high-throughput, also, we have already proved that dCas9/sgRNA could abolish the binding between cis-elements and trans-factors in a steric hindrance way, on the basis of these results, our proposal is to use lenti-dCas9/sgRNA to target human and mouse endogenous TP53 gene region in a tiled way, use FACS sorting and deep sequencing to test the interfering effect to TP53 transcription, and then identify corresponding transcriptional factors or DNA binding proteins by enChIP-MS after discovering candidate cis-elements. By accomplishing this project, we could develop an effective strategy by targeting the entire potential regulation region to screen and identify the regulatory effects between unknown transcriptional factors/DNA binding proteins and cis-elements.

从功能基因组学研究方法的角度来看，目前还没有一种有效的研究方法能够高通量的探究一个给定的区域可能被哪些转录因子或DNA结合蛋白所调控，开发这样的方法已具有必要性。基于CRISPR/Cas9系统具有高效特异的靶向性和适应高通量制备的特点，以及在申请人证明dCas9/sgRNA可通过空间位阻效应阻断顺反因子相互作用的基础上，本课题拟利用lenti-dCas9/sgRNA文库针对人和小鼠内源的TP53基因进行覆盖式的靶向结合，通过流式细胞分选根据对TP53基因转录调控的干扰效果分成不同组，再通过深度测序确定候选顺式元件。对于这些顺式作用元件，利用基于dCas9/sgRNA的enChIP-MS反向鉴别反式作用因子。通过完成上述计划，申请人能够建立一种针对一个基因的所有潜在的调控区域，包括其上下游以及内含子在内的所有DNA序列，高通量的筛选和鉴定影响基因转录调控的顺反因子的新方法。

在高通量测序技术已相当发达的后基因组时代，功能基因组学的研究方法依然较为受限。本项目利用dCas9/sgRNA与靶点的高亲和性、高特异性及空间位阻效应阻断顺反因子相互作用，以探究一个给定的基因组区域可能被哪些转录因子或DNA结合蛋白所调控，以此开发一种新的功能基因组学研究方法。项目以TP53基因区域为对象，完成了报告细胞系的建立，lenti-dCas9/sgRNA慢病毒文库的包装构建，以及对靶区域中顺式调控元件的筛选和确定。项目组利用dCas9/sgRNA对靶位点的高亲和性与空间位阻效应，证实了激活调控元件的区域被靶向后表达下降，少部分预测为抑制调控元件的区域被靶向后表达上升，可高效的对顺式调控元件进行筛选。该成果能够为功能基因组学的相关基础研究提供新的技术路径，提高科研工作效率。基于本基金的支持，负责人发表了标注基金号的通讯作者SCI论文2篇，其他论文若干。