利用Ovastacin-mCherry转基因小鼠研究哺乳动物皮质颗粒的动态转运及调控机理

Polyspermy, an abnormal fertilization, forms multiple pronuclei by allowing more than one sperm entry into the eggs, which would cause early embryonic lethality. The block to polyspermy is related to a unique organelle called cortical granules located in the cortex of unfertilized oocytes. Following fertilization, cortical granules undergo exocytosis to release their contents into the perivitelline space, and then modify the extracellular matrix to prevent polyspermy. The previous studies on the cortical granules mainly originate from invertebrates such as sea urchin, little is known about contents and functions of mammalian cortical granules. Not till recently, Ovastacin has been firstly identified as one of the components of cortical granules in the mouse. Thus, the present project will establish an Ovastacin-mCherry transgenic mouse model, taking advantage of Ovastacin as the marker of cortical granules to investigate its dynamic trafficking and regulatory mechanisms during mouse oocyte maturation and fertilization, explicating the molecular basis regarding the fertilization failure and polyspermy caused by the aberrant translocation and exocytosis of cortical granules. Also, density gradient centrifugation coupled with fluorescence-activated cell sorting will be used to isolate and identify more contents of cortical granules to discover their extra functions in the reproduction, providing fundamental basis to learn the significance of mammalian cortical granules in the reproductive biology and medicine.

多精受精是指超过一个精子进入卵子形成多个原核的异常受精形式，最终会导致早期胚胎死亡。卵子防止多精受精的机制主要与一种被称为皮质颗粒的特殊细胞器有关，它是存在于未受精卵母细胞皮质区的一层分泌囊泡。受精后，皮质颗粒释放其内容物至卵周隙，修饰细胞外基质以阻止多精受精。目前有关皮质颗粒成分和功能的认识主要来自于海胆等无脊椎动物，对哺乳动物的皮质颗粒知之甚少。最近，在小鼠中Ovastacin首次被鉴定为哺乳动物的皮质颗粒成分，负责受精后切割卵透明带中的精子受体ZP2来防止多精受精。本项目将利用Ovastacin作为皮质颗粒的标识物，构建Ovastacin-mCherry转基因小鼠，探索皮质颗粒在卵子成熟和受精中的转运及调控机制，阐明皮质颗粒转运和释放异常导致受精失败和引起多精受精的根本原因，并分离鉴定皮质颗粒的其它未知成分和功能，为全面了解哺乳动物皮质颗粒在生殖生物学和生殖医学中的意义提供研究基础。

皮质颗粒是卵子中预防多精受精的重要亚细胞结构，但目前对其认识非常有限，在哺乳动物中Ovastacin是唯一已知成分，因此对Ovastacin动态转运的深入研究将加深我们对受精生物学过程的认识和理解。本项目立足于基础研究，分别以小鼠和猪卵母细胞为实验模型，针对Ovastacin对受精过程的调控作用及环境因素如何通过Ovastacin影响受精的机制展开研究。经过4年的攻关，各项研究工作稳步推进，并达到了预期的研究目标。通过研究，1）我们揭示了哺乳动物卵子皮质颗粒从高尔基体向皮质区的迁移的机制，发现这一过程是依赖于细胞骨架微管和微丝。此外，迁移后，其在卵子皮质区的定位是动态流动的，该过程依赖于脂质的流动性，而不依赖于细胞骨架。我们还发现成熟卵子中无皮质颗粒区的产生依赖于微丝帽的形成，记录了受精后皮质颗粒在瞬间释放内容物防止多精受精的过程；2）阐明了Ovastacin的错误定位导致受精失败和雌性动物不育的机制。我们鉴定出了Ovastacin在皮质颗粒的定位信号肽，显示其位于Ovastacin的N端52-64位氨基酸序列。缺失定位信号肽的突变Ovastacin不能进入卵子皮质颗粒，而是散在分布于胞质中，导致卵子透明带中精子结合位点ZP2在受精前提前丢失，丧失精子结合能力，造成受精失败和雌性动物不育；3）阐释了环境因素和老化通过破坏Ovastacin分布引起受精失败的机理，发现环境毒素BaP和BPA以及排卵后老化过程会损害皮质颗粒的分布以及破坏Ovastacin的定位和蛋白量，通过抑制卵子结合精子的能力降低受精率。然而抗氧化物褪黑素能部分恢复环境毒素BaP和BPA以及排卵后老化过程诱导的Ovastacin异常以及受精失败。我们的研究成果与之前报道的受精后皮质颗粒释放Ovastacin切割ZP2防止多精受精的结论共同形成了‘ZP2切割时间点决定受精成败’的理论，支持了ZP2作为精子结合位点的观点，丰富了受精调控机理的理论知识，为研究其它环境或病理因素对卵子受精能力、卵子质量以及动物繁殖力的影响，以及抗氧化物在其中的应用提供了理论依据。