LIFU介导载质粒超声微泡靶向调控颈动脉体P2X3受体表达治疗慢性心力衰竭

Denervating carotid body (CB) to decrease the activity of sympathetic nervous system (SNS) is investigating for the treatment of chronic heart failure (CHF). However, destroyed CB by surgical resection or ablation has several limitations including uncontrollability, traumatic and respiratory function disturbance. P2X3 receptor, widely spread in human tissues, plays a key role in the signal transmission of CB and intravenously using its antagonists could dose-dependently decrease the CB and SNS activity, but lack of selectivity. We aimed to construct the P2X3 gene knock-out plasmid by CRISPR-Cas9 system and combine it with targeted cationic lipid microbubble to produce a P2X3 knock-out plasmid targeted microbubble (PTMB) with excellent physical properties and favorable imaging and targeting effects. Our study would further investigate the transfection efficiency in vivo and the relationship between the dosage of PTMB and the expression of CB P2X3 receptor. Finally, we intended to regulate the dosage of PTMB to quantitatively downregulate the expression of CB P2X3 receptor, controlled decrease the activity of CB and SNS, and improve the cardiac dysfunction, cardiac remodeling and prognosis of CHF. This study will provide theoretical and experimental foundations for performing safety, efficient and controllable CB modulation therapy and also optimize the clinical strategy for CHF patients.

消融颈动脉体（CB）降低交感活性是治疗慢性心力衰竭（CHF）的重要探索方向。但毁损CB存在不可控、创伤大、损害呼吸调节功能等缺陷。P2X3是CB信号传导的关键受体，同时在全身组织广泛分布，静脉使用该受体阻断剂可剂量依赖性降低CB和交感活性，但选择性差。项目拟利用CRISPR/Cas9技术构建P2X3基因敲除质粒，并将其与靶向阳离子脂质微泡整合，构建出物理性能良好、造影效果与寻靶能力俱佳的载P2X3敲除质粒靶向超声微泡（PTMB）。项目还将验证在低强度聚焦超声介导下PTMB的体内转染效率及其剂量与CB P2X3受体表达水平之间的量-效关系。最终通过调控PTMB的剂量，靶向、定量下调CB P2X3受体的表达，控制性调节CB和交感活性，改善CHF的心功能异常、心室重构和预后，为实现CHF安全、高效、可控的CB调节治疗提供理论和实验基础，为优化CHF的治疗策略提供新手段。

背景和方法：消融颈动脉体（CB）降低交感活性是治疗慢性心力衰竭（CHF）的重要探索方向。但毁损CB存在不可控、创伤大、损害呼吸调节功能等缺陷。P2X3是CB信号传导的关键受体，同时在全身组织广泛分布，静脉使用该受体阻断剂可剂量依赖性降低CB和交感活性，但选择性差。项目拟利用CRISPR/Cas9技术构建P2X3基因敲除质粒，并将其与靶向阳离子脂质微泡整合，构建出物理性能良好、造影效果与寻靶能力俱佳的载P2X3敲除质粒靶向超声微泡（PTMB）。项目还将验证在低强度聚焦超声介导下PTMB的体内转染效率及其剂量与CB&nbsp;P2X3受体表达水平之间的量-效关系。.实验结果：项目利用CRISPR/Cas9技术成功构建P2X3-gRNA质粒。微泡体外物理性能检测发现，合成微泡具有粒径均匀、分布适中、表面光整、且具有良好的超声敏感性和安全性。使用超声微泡与CHF犬CB进行体内转染，RT-PCR发现P2X3受体mRNA的表达较对照组降低54%，western-blot也发现实验组CB P2X3蛋白表达显著低于对照组（P<0.01)。此外，分别使用5ml、10ml、15ml超声微泡进行体内转染，RT-PCR发现CB P2X3受体 mRNA表达分别下调了近48%，54%和57%，Western-blot结果同样显示，P2X3受体蛋白的表达在3组中，随着微泡注射量的增加而减弱。CB免疫组化染色也实验组P2X3表达强度显著低于对照组，提示存在量-效关系。动物实验发现，与对照组相比，实验组在低氧刺激后的呼吸频率和每分通气量显著降低，提示CB活性受抑制。此外，实验组外周血去甲肾上腺水平、LF/HF、星状神经节TH和GAP43表达显著降低，提示机体交感活性受抑制。此外实验组的LVEF、LVEDD、IVSD值以及心肌纤维化百分比显著低于对照组，且呈剂量-效应关系，提示该治疗方案能够改善CHF犬的心功能和心脏重构。.结论：LIFU介导下利用PTMB能够有效降低CB P2X3受体表达，降低CB和全身交感活性，改善CHF犬的心功能和心肌纤维化，并在一定范围内程剂量-效应关系。因此，本项目为实现CHF安全、高效、可控的CB调节治疗提供理论和实验基础，为优化CHF的治疗策略提供新手段。