漆酶介体体系(LMS)中活性物质的形成与演化分子机理

Laccase, a ubiquitous multi-copper oxidase in fungi and plants, can break down environmental pollutants such as lignin and polycyclic aromatic hydrocarbon in the presence of certain small molecules (so-called "mediators"); the enzyme uses dioxygen (O2) in air as the electron acceptor to produce water, without releasing hydrogen peroxide. This is a clean way of biodegradation, possessing highly scientific value in environmental chemistry and great potential in environmental protection and bio-energy fields. On a basis of applicants' studies on N-/O-/C-centered radicals, organic reaction mechanisms, and catalytic reaction mechanisms, we will investigate laccase-mediator systems, particularly about the formation and evolution of reactive species inside, by means of stopped-flow chemical kinetic, spectroscopically stoichiometric analysis, and computationally structural characterization: 1) use molecular docking to rationalize the structural matching between these enzymes and substrates/mediators; 2) use kinetic experiment to capture key intermediates, and confirm their presences with HPLC-MS and UV-vis spectroscopy; 3) use quantum chemical calculation to illustrate the formation and evolution of reactive species such as phenoxyl, carbon-centered, and hydroxyl radicals, analyzing the related transition structures and reaction rates; 4) construct kinetic models and resolve the complicated biochemical processes in LMSs. Our research findings will provide insightfully theoretical fundation for screening and employing high-quality laccase-mediator systems.

漆酶是一种广泛存在于真菌和植物中的多铜氧化酶，在合适的小分子介体协助下可以降解木素和多环芳香化合物等环境污染物；它可以利用空气中氧气作为电子受体，不产生过氧化氢，直接生成水，这是一种洁净的生物降解的途径，在环境化学领域具有重要的科学价值，在环保和能源领域具有较大的应用潜力。基于申请人对氮/氧/碳自由基、有机反应机理与催化反应机理等方面的研究积累，拟通过停留动力学实验、光谱学计量分析、结构计算表征，对漆酶-介体体系（LMS）展开如下研究：1）通过分子对接研究不同来源漆酶与底物和介体的匹配性；2）通过动力学实验，捕捉关键中间产物，并通过质谱和光谱学进行验证；3）通过量子化学计算来阐明其中酚氧-、碳中心-、羟基-自由基等活性物质的形成和演化过程，并分析过渡态结构和反应速率；4）构建并解析LMS中复杂动力学模型。该项研究结果可为筛选和应用优良的漆酶-介体体系LMS打下理论基础。

漆酶是一种广泛存在于真菌和植物中的多铜氧化酶，在合适的小分子介体协助下可以降解木素和多环芳香化合物等环境污染物；它可以利用空气中氧气作为电子受体，不产生过氧化氢，直接生成水，这是一种洁净的生物降解的途径，在环境化学领域具有重要的科学价值，在环保和能源领域具有较大的应用潜力。在本项目的资助下，我们以白腐菌Trametes versicolor漆酶介体体系为研究入手点，结合分子生物学公共数据库中不同物种来源的漆酶基因序列信息和三维结构信息，通过分子建模和分子对接计算和分析了底物和介体小分子与漆酶活性口袋的结合力，从而在原子和分子水平揭示了底物和介体匹配性；构建了漆酶LMS动力学实验平台，收集和分析已知介体分子的漆酶催化反应动力学光谱特征，利用固定化漆酶技术实现相分离以研究阴离子介体效应，发现了氯离子抑制效应和醋酸根激动效应；以丁香油酚和异丁香油酚为小分子探针，描绘了漆酶催化氧化木质素类分子的反应通路草图，通过快速分子光谱学和高分辨质谱捕获了酚氧自由基与碳中心短寿命自由基中间体，结合量子化学过渡态活化能计算和自由基紫外可见吸收光谱计算表征，验证和阐明了活性自由基中间体之间的演变和转化途径；在洞悉了漆酶LMS体系复杂动力学模型的基础上，我们开展真菌生长环境来源的天然介体活性物质初筛和代谢物组分析，实验中除了重复发现4种已有文献报道的天然介体小分子外挖掘到7种新型潜在天然介体分子；为了研发漆酶LMS 休止细胞转化系统，我们探索和构建血红蛋白作为一种新型蛋白质介体协助催化降解木质素，并利用2D-NMR和LCMS等现代仪器分析技术探测血红蛋白的介体效应，该蛋白介体系统已经在实验室中成功应用于环境污染物双酚A和二氯酚的生物酶法降解；针对漆酶的氯离子抑制效应，我们利用分子模拟方法分析了氧气和小分子抑制剂在漆酶内分子输运途径，以求通过分子设计技术改造通道周边氨基酸残基解除漆酶在高盐环境中的不耐受性。本项目的研究结果为筛选和应用优良的漆酶-介体体系奠定了理论基础。