Piezo1机械力敏感离子通道的定量生物学和合成生物学研究

Synthetic biology utilizes engineering approach to adapt, improve and design biological components, construct synthetic gene circuits. These circuits can be used to optimize cellular programs for information processes and other functions according to human design. Synthetic biology is in the process of helping fight against diseases and improving human health. Mechanical sensing is one of the most fundamental and critical biological signal processes. However, there is no successful attempt reported for engineering mechanical sensing for synthetic biology applications. Here we perform systematic quantitative characterization of Piezo1, the most promising mechanical sensing ion channel. Specifically, we investigate how the interactions between it and the host cell affect its sensing to static stress and sonic wave. By using a synthetic expression tool to reduce heterogeneity in exogenous gene expression, we observed two novel phenomena, Piezo1 channel opening is response to shear stress in a biphasical manner, and it is sensitive to a specific frequency of sound vibrations. Before go along with engineering Piezo1 for synthetic biology applications, we will investigate the possibility of desensitization by larger shear stress, and if the cytoskeleton of host cell serves as a sound vibration filter. Towards these efforts, we will a technology to enable direct apply high frequency vibration to membrane or cytoskeleton of host cell. Finally we will express Piezo1 into A549 cells, to determine if it could sense the stiffness increase accompany EMT and metastasis, and investigate the viability of using it to construct synthetic circuit to detect cancer metastasis.

合成生物学利用工程化的思想，改造设计生物元件，构建合成基因线路，对细胞功能进行优化编程，使其能够按设计需求处理信息和行使功能，从而实现抵抗疾病和改善人类健康的目的，现已取得重大的基础和应用研究突破。然而力学感应这个生命过程中至关重要的信号系统，至今尚未被合成生物学成功改造。本项目通过对机械力敏感离子通道Piezo1的系统、定量刻画，研究其与外源表达的底盘细胞在静态和动态外力下的感知机制。通过运用合成生物学工具降低Piezo1外源表达的异质性，我们发现其开启只限于静态剪切力的特定强度以及音频振动的特定频率。在对其进行合成生物学改造前，我们也将对高强度剪切力脱敏和底盘细胞骨架对频率滤波的科学问题进行进一步的研究。为此我们将发展对细胞膜或细胞骨架直接施加高频力学扰动的技术，也将检测Piezo1的力学感知能够识别发生转移的肺腺癌细胞的现象，探讨Piezo1用于合成生物学肿瘤转移诊断基因线路的可行性

Piezo1 和Piezo2机械力敏感离子通道在人体内各种力学感知过程中起到传感器的作用，同时也与多种疾病的发生发展存在一定的关联性。建立力感知的合成生物学有助于用于估测2维及3维环境中细胞所受力学作用的遗传学方法。力感知元件表达量的异质性会影响其感知效果。为了找到降低外源基因表达异质性的规律，我们研究了诱导表达基因异质性的来源，发现了基因转录与组蛋白乙酰化形成一个正反馈回路，从而可能导致双稳态和高异质性。我们进一步在两个方面研究降低基因表达异质性的方法，1）长周期PWM动态调节和负反馈调节， 2）表观遗传异质性非常小的基因组位点。我们验证了二者结合实现基因表达的高度均一性。我们发现表达Peizo1的CHO细胞可以感知很小的剪切力（~0.3Pa）,开启Piezo1离子通道，且开启延时逐渐缩短，然而在更高的剪切力（~3Pa），Peizo1的开启反而降低，我们在内源表达piezo1的乳腺癌细胞（MCF7）和脐带血管上皮细胞（HUVEC）观测到类似现象，用latrunculin A破坏细胞的microfilament不能去除这个非单调剪切力响应现象。我们用共聚焦显微镜和TIRF显微镜发现Piezo1在静态及较小剪切力下，在细胞膜上呈团聚分布，而较大的剪切力可以动态降低Piezo1的团聚性。为了进一步量化piezo1团聚性，我们实现了在剪切力作用的不同时间cross-link 细胞，并进行STORM/PALM超分辨成像，验证了在低剪切力下piezo1团聚程度稳定，在高剪切力下piezo1团聚程度降低与胞内钙离子变化的一致性。据此我们得到的结论是细胞膜上piezo1的团聚提高其对剪切力的敏感性，高剪切力降低piezo1团聚性。这个团聚性不完全由细胞骨架决定。我们用Piezo1和NFAT-GFP组成力感知基因表达的合成生物学线路，发现这个线路能够感知细胞在2维培养下所受力远远大于3维细胞团培养，但是这种测量对力的敏感度不足以检测细胞外基质硬度的差别。因此我们改为开发基于YAP1的力感受线路，用于研究肿瘤细胞EMT前后的变化。我们也搭建了射频磁场线圈和细胞膜、细胞骨架偶联磁纳米颗粒的系统。