棕榈酰化对BK钾离子通道机械力敏感性的调控机制

BK as a mechanosensitive channel plays important roles in many physiological processes. Studies have confirmed that some BK potassium channels in response to membrane stretch attribute to its STREX domain conveying stress in the membrane to the gate of the channel, deleting the STREX domain abolishes the mechanosensitivity of the BK channel. However, it is not clear that how does STREX domain sense the membrane stress. Our previous results show that palmitoylation of Cys646 and Cys647, which are two palmitoylation sites within the STREX domain, could anchor STREX domain to the plasma membrane. Therefore, we speculate that it may be necessary to regulate the mechanosensitivity of BK channels for the STREX domain anchoring to the plasma membrane. The preliminary result shows that mutation of the two palmitoylation sites (Cys to Ala) at the same time in the STREX domain decreases the mechanosensitivity of BK channels significantly. Based on the above speculation, patch clamp and confocal laser microscope techniques will be performed, to further explore the effect of palmitoylation of STREX domain in different levels on the mechanosensitivity of the BK channel. In the study, we will exploit genetic mutations in different palmitoylation sites separately and adding palmitoylation inhibitors of different concentrations to detect the concentration-response relationship between plasma membrane anchoring and mechanosensitivity. This study will elucidate the regulatory mechanism of the mechanosensitivity of BK potassium channels conferred by palmitoylation.

BK作为一种机械敏感性离子通道在许多生理过程中发挥重要作用。研究证实某些BK通道的机械力敏感性是由细胞膜形变传递机械力并通过STREX结构域到达通道的门控区实现的；当STREX结构域被缺失突变后，BK通道的机械力感受性丧失。然而，对于STREX结构域如何感受细胞膜上的机械力尚不清楚。申请人前期发现STREX结构域上Cys646和Cys647两个位点的棕榈酰化可以将其锚定在质膜上，据此推测，STREX结构域的质膜锚定可能是BK通道感受细胞膜机械力的基础。预实验结果初步证明，将这两个Cys同时突变成Ala后，BK通道的机械力敏感性显著降低。本项目将在前期工作基础上采取棕榈酰化位点分别突变和加入不同浓度的棕榈酰化抑制剂，利用单通道膜片钳、激光共聚焦等技术，进一步探讨STREX结构域的质膜锚定与BK通道机械力敏感性的量效关系，以期阐明棕榈酰化对BK钾离子通道机械力敏感性的调控机制。

BK通道广泛分布，尤其在中枢神经系统中大量表达。因其大电导，它的开放可引起大量钾离子外流，这可有效调节膜的兴奋性、胞内离子稳态以及细胞体积改变等，所以BK通道对机体的许多生理活动发挥重要的调节作用。在中枢神经系统中，BK通道可以影响动作电位的形状、频率和传播以及突触前末梢神经递质的释放；也能直接影响基因的表达转录和神经元形态结构。因此，研究BK通道的特性及其功能具有重要必要性。本研究通过基因突变、膜片钳技术、激光共聚焦技术等探讨棕榈酰化对BK通道机械力敏感性的调控机制。我们研究发现，鸡胚心脏来源BK通道野生型STREX片段可以大量表达在质膜周围，而将STREX结构域内棕榈酰化位点Cys646和Cys647突变成丙氨酸之后，STREX片段则主要分布在细胞质内，这表明棕榈酰化可以影响BK通道的质膜靶向作用；将STREX结构域内棕榈酰化位点突变之后，通道的生理功能和特性并没有改变，而且仍然表现出机械力敏感性，只是敏感程度上稍有降低，这表明棕榈酰化并不能对BK通道的机械力敏感性起着决定性作用。于是我们得到这一结论：棕榈酰化并不是使BK通道表现出机械力敏感性的决定因素。这一研究将为BK通道特性的研究提供参考意义，同时也促使我们寻找其他思路进一步探究BK 通道机械力敏感性的调控机制。此外，我们利用离体脑片电生理记录平台进行了一些拓展研究，探索了BK通道对大鼠海马区神经网络振荡的调控。我们得到如下结果：对于在人工脑脊液中的大鼠脑切片，通过卡巴胆碱诱导出神经网络振荡，然后加入BK通道阻断剂paxilline和iberiotoxin，均发现阻断BK通道可以兴奋神经网络，使海马区γ振荡功率增加；之后加入钙通道阻断剂，发现BK通道与钙通道对神经网络发挥协同调控作用，并且BK通道的调控与AMPAR也有相关性。这一研究提示我们BK通道确实在大鼠海马区的神经网络活动中发挥重要的作用，从而为我们进一步了解BK通道的生理功能，为研究其在某些临床疾病中的病理机制提供更多的实验依据。