新型机械敏感离子通道PIEZO1声敏特性研究

Sonogenetics is a novel technique proposed after the optogenetics， which is used in the neural circuits’ research to targeting identify single neuron and touch the targeted nerve cell located in deeper brain region. Ultrasound remotely and non-invasively acts on the mechanosensitive ion channel of cell membrane with ultrasonic stimulation, and then activates cells. This technique can effectively make up and solve the problem existed in the neural circuits’ research. However, the available acoustic sensitive medium is very inadequate. With previous works about the ultrasonic stimulation on micro-carriers, we have mastered the method that makes the micro-carriers vibrating and amplifies acoustic mechanical force. The novel mechanosensitive ion channel Piezo1 has a remarkable mechanosensitivity. In this project, we would like to use the Crispr/Cas9 technique to active and knock out of the Piezo1 gene. Changes of mechanosensitive ion channel’s current, calcium ions concentration, calpain and cell’s immigration behavior et al. will be investigated with the patch-clamp, laser scanning confocal microscope technique et al., when the mechanical force produced by ultrasonic stimulation on micro-bubbles acts on cells with and without the mechanosensitive ion channel proteins. The completion of this project will prove the ultrasonic sensitivity of the protein and its sensitive property, and provide an effective ultrasonic sensitive medium for the application and development of sonogenetics in manipulating cell function research.

声遗传学技术是继光遗传学技术之后提出的一新技术,用于神经通路研究中靶向定位和触及大脑深处单个目标神经细胞。超声能够远程无创的作用于细胞表面机械敏感离子通道，激活细胞，有效的解决神经通路研究中存在的问题。但是，其可用的声敏介质还很欠缺。前期通过超声刺激微载体的实验工作，我们已经掌握和实现使载体产生震动，放大声机械力的方法。结合目前新发现的，具有卓越机械敏感离子性能的Piezo1通道，课题拟采用Crispr/Cas9技术对细胞上Piezo1基因进行敲除和激活, 研究不同超声刺激微泡产生的机械力作用于高表达和不表达Piezo1机械敏感离子通道蛋白的细胞，对细胞膜上机械敏感离子通道电流，细胞内钙离子浓度，钙蛋白酶和细胞迁移行为产生的影响，以论证携机械敏感离子通道蛋白细胞对声的敏感性，并探讨其声敏特性，为声遗传学技术在操纵细胞功能研究中的应用提供可靠的声敏介质。

本课题以Piezo1机械敏感离子通道蛋白为研究对象，采用不同超声作用于构建成功的Piezo1蛋白抑制和未抑制细胞探索Piezo1蛋白对超声刺激的敏感性，以及超声作用对下游分子，及对细胞生物学功能和生理功能的影响。通过对超声刺激参数的验证，发现超声刺激强度和刺激时间都对细胞具有明显的影响。过强的超声强度及较长的时间刺激都对细胞具有不利影响。在保证细胞功能的刺激条件下，发现Piezo1蛋白的活性能够被超声激活，引起钙离子加速内流。通过对被刺激后Piezo1蛋白表达抑制和未抑制细胞内下游因子 MLCK的量及ATP的量检测，发现Piezo1蛋白抑制组内激活的MLCK的量和ATP的消耗都比Piezo1未抑制组的细胞高。说明超声刺激导致细胞通透性的增加，而Piezo1蛋白的抑制减少了这种通透性。通过对被刺激后细胞内NO、cGMP和AngII的测量发现，Piezo1未抑制的细胞内逃逸的NO的量比抑制组的低；超声刺激能引起cGMP有微弱的升高，但是Piezo1蛋白的表达对他们无影响；被刺激细胞内AngII的含量不受超声刺激和Piezo1蛋白的影响。说明超声刺激和Piezo1蛋白的抑制对细胞的能够引起血管舒张功能。 因此，本项目的研究确定了Piezo1蛋白对超声的敏感性，并且超声刺激下，Piezo1能够调控细胞的生理学和生物学功能的变化。该发现在肿瘤，心血管疾病，骨骼及神经系统等疾病的治疗中具有潜在的应用前景，另外在探索脑神经功能领域也具有良好的应用前景。