基于杂交突变体筛选菘蓝抗流感病毒活性成分的新方法研究

Banlangen is a typical representative of the anti-viral Taditional Chinese Medicine, which has good clinical effect. For a long time, its active material foundation and action mechanism of anti-viral are not clear. Our group select Isatis indigotica which is the original plant of Banlangen for the study, and have distant hybridization with Brassica napus which is a related plant of Isatis indigotica and absolutely no antiviral activity, to get artificial mutants group of Brassica napus and Isatis indigotica. Advantage of this special genetic material, we make Isatis indigotica as a positive control and Brassica napus as a negative control, and analysis the metabolism and anti-influenza virus activity invitro of artificial mutants group to screen the artificial mutants with anti-influenza virus activity. We research the bioinformatics analysis, chemical analysis and activity evaluation of the difference metabolites between the artificial mutants with anti-influenza virus activity and Brassica napus, to screen anti-influenza virus active components from Isatis indigotica. At last, we collect medicinal materials of Banlangen and Daqingye to confirm the screening results, and establish a new method of the screening of anti-influenza virus active components from Isatis indigotica based on artificial hybrid mutants of Brassica napus and Isatis indigotica.

板蓝根是抗病毒中药的典型代表，临床效果良好，但长期以来，其抗流感病毒物质基础和作用机制并不明确。本项目组选择板蓝根原植物菘蓝为研究对象，与完全不具有抗病毒活性的同科近缘植物油菜杂交，获得菘蓝人工突变群体。利用这一特殊遗传材料，以菘蓝作为阳性对照、油菜作为阴性对照，对人工突变群体进行植物代谢组学分析和体外抗流感病毒活性评价，筛选出具有流感病毒抑制作用的人工突变体。并对其与油菜的差异代谢物进行生物信息学分析、化学分析和活性评价，进而筛选出菘蓝抗流感病毒活性成分。最后，收集大青叶和板蓝根药材对筛选结果进行验证，建立基于远缘杂交创造的人工突变体进行菘蓝抗病毒活性成分筛选研究的新方法。

菘蓝（Isatis indigotica）是清热解毒类中药的典型代表，临床上广泛应用于治疗流行性感冒；但其抗流感病毒活性物质基础目前尚不清楚，极大的影响了相关药物的开发和应用。造成其抗流感病毒物质基础和作用机制并不明确的主要原因是其化学成分十分复杂，且各成分之间的含量差异也很大，既无含量优势成分，亦无药效优势成分，采用传统中药化学研究方法对此进行研究有极大的掣肘。本研究基于植物远缘杂交技术，将具有流感病毒抑制作用的菘蓝的染色体附加到完全不具备相同性状的同科植物油菜中，形成杂交突变体；通过外源基因引入有利性状创造的特殊遗传材料，来筛选其抗流感病毒活性成分，阐述作用机制。植物代谢组学分析表明，“菘蓝型油菜突变体”Maals-27中，菘蓝原有化学成分从种类到数量都被极大“稀释”；而油菜研究背景明晰、不具有抗流感病毒作用，故仅通过对Maals-27和油菜差异代谢物的分析，即可从中筛选出菘蓝抗流感病毒活性成分，客观上将菘蓝多组分、多靶点、多途径作用研究“分解降维”。本研究以LC/MS引导分级分离为指导，通过常规中药化学分离方法，从菘蓝中分离得到5个差异化合物。通过对这5个成分的含量比较分析及体外抗流感病毒活性评价，成功筛选出2个具有流感病毒抑制作用的活性成分AC-1和AC-2，其对流感病毒PR/8株的半数抑制浓度IC50分别为1.84 μmol/mL和1.79 μmol/mL, 选择指数SI分别为3.5和1.3. 这是人们第一次探索通过药用植物远缘杂交创造的人工突变体的方法来进行中药复杂体系的活性物质筛选，为中药活性成分筛选和复杂体系的研究提供新的研究思路和方法。