Sall1调控多能干细胞naive和primed状态转化的机制研究

Naïve embryonic stem cells (ESCs) and primed epiblast stem cells (EpiSCs) are derived from epiblast of blastocyst (E3.5-4.5) and post-implantation embryo (E5.5-7.5) respectively. However, the characteristics of these two pluripotent stem cells and the molecular mechanism of the control the transition between them are still not clear. Recently, we’ve established mouse expanded potential stem cells (Nature, 2017); moreover, we designed whole genome gRNA library combing with dead Cas9 (dCas9) linked with DNA activation domain to screen genes in EpiSCs reprogramming and found a new candidate gene Sall1. In this project, at first, we will validate Sall1’s function in EpiSCs and somatic cell reprogramming; investigate its roles in the conversion of naïve ESCs to primed EpiSCs, the three lineage differentiation of ESC by overexpression or knock-out Sall1 in ESCs; then, examine the synergistic effects of Sall1 and its partner Nanog (a key naïve pluripotent factor) in reprogramming and conversion of naïve ESCs to primed EpiSCs; finally, identify the down-stream target genes of Sall1 and Nanog by RNA-Seq and investigate the regulation of target gene expression. The data generated in this project will provide new insights into early embryo implantation and lineage commitment of mouse and human and the mechanism of reprogramming, which will not only advance the research in biology but facilitate future application in biomedicine as well.

Naïve胚胎干细胞（ESCs）和primed 上胚层干细胞（EpiSCs）分别是从小鼠植入前囊胚和植入后早期上胚层分离得到的多能干细胞，但是这两种干细胞的特性以及相互之间转化的调控机制至今尚不清楚。我们前期建立了小鼠扩增性潜能多能干细胞（Nature，2017），在此基础上我们应用CRISPR-Cas9技术筛选又获得了重编程EpiSC的新基因Sall1。本课题将对Sall1重编程primed EpiSCs、小鼠和人成纤维细胞进行功能鉴定；观察Sall1过表达、敲除对ESCs转化为EpiSCs和三胚层分化的影响；分析Sall1与干性基因Nanog在重编程以及naïve ESC向primed EpiSCs转化的协同作用；并利用RNA-Seq检测相关下游基因及其潜在的分子机制。最终为深入了解早期胚胎植入和细胞分化的机制提供关键的参考依据，研究结果具有重要的生物学意义和应用价值。

哺乳动物的胚胎发育开始于单个全能性的受精卵，经历不同的发育阶段后最终长成完整的个体，在此过程中细胞的分化潜能逐渐降低。与之相对应，现已从不同发育阶段的胚胎中分离、建系了naïve、formative和primed等不同分化潜能的多能干细胞。对这些不同状态的多能干细胞之间相互转换的机制进行深入研究，不仅有助于揭示重要的生物学机制，也将促进再生医学的发展。本项目通过CRISPRa（CRISPR activation）全基因组筛选，发现了包括Sall1、Oct4、Umodl1等多个促进primed EpiSCs（epiblast stem cells）转换为naïve ESCs（embryonic stem cells）的因子。随后的研究验证了Sall1与Nanog协同促进这一转换和成纤维细胞重编程；Sall1过表达和敲除实验发现它也影响了naïve ESCs转换为primed EpiSCs；而在小鼠受精卵中敲除Sall1，则会导致囊胚发育受阻。多组学测序发现并验证了Klf5, Fam189a2为介导Sall1, Nanog作用的靶分子。通过系统研究Sall家族其他成员在干细胞状态转换和分化过程中的研究，我们发现另一Sall基因在多能干细胞退出naïve状态时表达快速上调，将其敲除后naive状态的标志基因表达增加，促进naive ESCs增殖，减缓naïve ESCs转换为primed EpiSCs，并且影响了三胚层分化。鉴于primed EpiSCs转换为naïve ESCs的效率仍较低，且需通过遗传学或化学等方法，我们建立了高效，不依赖转录因子和小分子化合物的转换primed EpiSCs的方法，对其机制进行了一定的研究。基于不同状态多能干细胞的分化潜能的差异，我们建立了高效的心脏起搏细胞分化方法，为生物起搏器的研发提供了重要的细胞来源。本项目鉴定了多个参与多能干细胞状态转换的因子，建立了新的primed EpiSCs转换为naive ESCs的方法，为研究多能干细胞状态转换，胚胎发育和细胞重编程提供了理论和实验依据。本项目合计发表标注受项目资助的SCI论文5篇，代表性成果发表在Stem Cell Reports等刊物上。