E3泛素连接酶ZFIP1与锌指蛋白ZFP182的互作在水稻抗逆反应中的作用

ZFP182是本实验室鉴定的具有抗逆功能的水稻锌指蛋白。通过酵母双杂交鉴定了一个RING E3泛素连接酶ZFIP1能够与ZFP182互作，表明ZFIP1可能介导了ZFP182的泛素化修饰。本研究在已有工作基础上研究ZFP182与ZFIP1的互作在水稻耐逆性反应中的作用。首先进一步证实ZFP182和ZFIP1的互作及其在细胞内互作的场所；体外证实ZFIP1是否具有E3泛素连接酶活性以及是否能够介导ZFP182蛋白的泛素化；获得35S:ZFP182-GFP、35S:ZFIP1和35S:ZFIP1-RNAi水稻转基因植株以及它们它们的杂交后代，分析比较蛋白酶体抑制剂和胁迫处理下不同转基因植株ZFP182的稳定性、ZFP182下游胁迫相关基因的表达及转基因植株的耐逆性，阐明ZFP182与ZFIP1的互作在水稻非生物胁迫应答反应中的作用以及探讨这种互作在水稻抗逆基因工程中的应用价值。

本实验室前期从水稻中鉴定了一个C2H2型锌指蛋白基因ZFP182，该基因受低温、干旱和高盐等多种非生物胁迫的诱导，过量表达ZFP182的转基因水稻提高了耐逆性。通过酵母双杂交技术鉴定了ZFP182的互作蛋白，包括一个E3泛素连接酶ZFIP1。ZFIP1基因主要在水稻的根、穗和茎节中表达，受高盐、低温胁迫以及ABA的诱导。在pZFIP1::GUS的转基因水稻植株的幼根，幼穗和节中也检测到较强的GUS信号。在水稻原生质体中ZFIP1:GFP能够与一个核定位标签共定位，说明ZFIP1蛋白主要定位在细胞核。值得注意的是ZFIP1在酵母细胞中有很强的转录激活活性，而缺失分析表明RING环结构域对于转录激活活性是必须的。E3泛素连接酶活性分析结果表明ZFIP1具有E3泛素连接酶活性，且RING环的完整性对于泛素连接酶活性也是必须的。以上研究结果表明ZFIP1同时具有转录激活活性和E3泛素连接酶活性，且主要定位在细胞核内，表明ZFIP1在调控基因表达和蛋白质降解方面可能具有双重功能。获得了过量表达ZFIP1和RNAi抑制表达的水稻转基因植株，35S:ZFIP1转基因水稻植株相对于WT对低温更敏感，而35S:ZFIP1-RNAi干涉转基因株系提高了抗冷性。ZFIP1过量表达转基因水稻在盐胁迫下根的生长受到了更为显著的抑制，而ZFIP1的RNAi抑制表达能够使转基因植株对外源NaCl不敏感。此外，ZFIP1的抑制表达能够增强转基因植株对氧化胁迫的耐受性，提高活性氧的清除能力。在低温胁迫处理的野生型水稻中胁迫相关基因OsP5CS能被诱导表达，但在ZFIP1过量表达转基因植株中该基因的表达却受到了抑制，表明ZFIP1过量表达可能抑制了胁迫相关基因的表达导致转基因植株抗逆性下降。35S:ZFP182-GFP瞬时表达实验表明了ZFP182的蛋白不稳定性。为了进一步研究ZFP182与ZFIP1的关系，获得了35S:ZFP182/35S:ZFIP1-RNAi杂交后代，与35S:ZFP182相比，35S:ZFP182 /35S:ZFIP1-RNAi进一步提高了盐胁迫下的活性氧清除能力，表明ZFIP1对ZFP182的负调控作用。本项目揭示了ZFIP1的生物学功能以及ZFP182与ZFIP1互作在水稻耐逆应答反应中的作用，利用两个基因的组合将可能培育出抗逆性更强的水稻新材料，应用于水稻抗逆性遗传改良。