拟南芥泛素化E3连接酶DRIP1及其互作蛋白在响应水分胁迫应答中的分子机理

蛋白质泛素化是蛋白翻译后修饰的一种重要形式。研究表明DRIP1属于RING-类型单亚基的泛素化E3连接酶，它通过控制水分胁迫应答中的关键转录因子DREB2A的降解，对植物中干旱应答基因的表达起到负调控的作用。但它是如何感知胁迫信号，其E3连接酶活性的调控机理目前尚不清楚。发现和鉴定其互作蛋白是回答该问题的有效途径。为此我们利用酵母双杂交的方法从拟南芥的cDNA文库中筛选到一个特异与DRIP1蛋白相互作用，且功能未知的蛋白，其表达显著受到渗透胁迫的诱导。本研究将通过生物化学和遗传学的研究方法检测该蛋白对DRIP1泛素化E3连接酶活性的影响；阐明该基因在植物水分胁迫中的功能；揭示DRIP1感知水分胁迫信号及其活性调控的机理。本研究有可能发现和鉴定逆境信号传递中新的重要信号分子，揭示DRIP1蛋白活性受逆境信号的调控机理，为操纵多个干旱应答基因的表达提供新的途径和基因。

干旱是植物经常遇到的一种自然灾害，严重时会导致植物萎蔫死亡。胁迫激素ABA在植物受到干旱胁迫时会迅速积累，能促进气孔关闭，减少叶片水分散失，帮助植物抵御干旱。目前，关于ABA信号的研究，比较清楚地是以PYR/PYL/RCAR、PP2C和SnRK2s为核心的信号转导通路。在这个信号途径中，ABA激活的蛋白激酶SnRK2s通过磷酸化激活下游bZIP类转录因子调控胁迫应答基因表达，以及激活气孔保卫细胞中关键阴离子通道SLAC1调控气孔运动。然而除了蛋白磷酸化在ABA信号途径中发挥着重要作用，泛素E3连接酶对ABA合成关键酶、ABA受体、重要转录因子和调控蛋白的降解、激活和转运等丰度和活性的精细调节也起着极其重要的作用。但是仍有许多尤其是参与ABA信号途径中泛素E3连接酶的功能研究并不清楚，特别是胁迫信号如何激活E3连接酶活性也不是很清楚。.本研究发现拟南芥中一个新的RING类泛素E3连接酶基因CHYR1的表达显著受ABA和干旱胁迫诱导。该蛋白定位于细胞核、细胞质和内质网，主要在维管组织和气孔中表达。对CHYR1功能缺失突变体和功能获得植株分析发现CHYR1能促进ABA诱导气孔关闭，活性氧产生，提高植物的耐旱性。体外泛素化实验，显示CHYR1具有自泛素化活性，是一个有功能的泛素E3连接酶，并且能够介导形成48位赖氨酸连接的多聚泛素化链。.进一步分析方法发现ABA信号传递中的关键蛋白激酶SnRK2.6与CHYR1蛋白发生相互作用，并磷酸化CHYR1位于RING结构域的第178位苏氨酸残基，从而增强CHYR1的泛素E3连接酶活性。过量表达磷酸化缺陷的CHYR1蛋白（CHYR1T178A），能干扰体内正常的CHYR1功能，使得植物模拟chyr1功能缺失突变体表型，损害了ABA诱导气孔关闭和活性氧产生，导致对干旱胁迫的耐受性降低。而过量表达磷酸化状态的CHYR1蛋白（CHYR1T178D），可促进ABA诱导ROS产生和气孔关闭，提高植物对干旱胁迫的耐受性。在干旱胁迫下，相比野生型植株，LEA14、RD29A、RD20、RAB18、RbohD和RbohF等胁迫响应基因在35S:CHYR1和35S:CHYR1T178D中有更高地胁迫诱导，在35S:CHYR1T178A和chyr1中诱导表达显著降低。此外，同样位于RING结构域内的S173AS208A突变无论在体外还是体内均不影响CHY