具有转录激活活性的E3泛素连接酶OsSRFP1调控水稻耐冷性的分子机理研究

A stress related E3 ubiquitin ligase gene OsSRFP1 was isolated from rice in our previous study. The expression of OsSRFP1 was induced by mutiple abiotic stresses and overexpression of OsSRFP1 decreased cold tolerance while RNAi knock-down of OsSRFP1 increased cold tolerance in rice seedlings. Knock-down of OsSRFP1 stablized the cell memebranes and increased antioxidant activities through moduating gene expression and activities of reactive oxygen species scavaging enzymes. Interestingly, besides having the E3 ubiqutin activity, OsSRFP1 exhibited transcriptional activation activity in yeast and rice cells. Additionaly OsSRFP1 predominately located in the nucleus. These data indicate that OsSRFP1 was also likely a transcription factor. In this study, we will further analyze the molecuar mechanisms for OsSRFP1 in the modulation of cold tolerance, especially the dual roles of OsSRFP1 as an E3 ligase and a transcription activator. Our work will aid in our understanding of the mechanisms for RING finger proteins in cold responses in plants and provide a theory basis for breeding practice with OsSRFP1. The genome edition technology of CRISPR/Cas9 system will be employed to genetically engineer cold tolerant rice by knocking-out OsSRFP1, which could be directly applied in breeding practice.

申请人前期从水稻中分离了一个胁迫诱导的E3泛素连接酶基因OsSRFP1。OsSRFP1基因的表达受低温等多种非生物胁迫的诱导，其过量表达降低了转基因水稻的苗期耐冷性而RNAi转基因水稻显著提高了耐冷性。OsSRFP1基因表达量下降导致水稻的细胞膜更加稳定，抗氧化性显著增强。有意思的是OsSRFP1除了具有E3泛素连接酶活性以外，也具有转录激活活性，且主要定位于细胞核内，表明OsSRFP1有可能同时也具有转录因子的功能。本研究将在已有基础上深入研究OsSRFP1在低温胁迫下的作用机制，特别是胁迫下OsSRFP1如何行使E3泛素连接酶功能和转录激活功能的研究对于进一步理解植物响应低温胁迫的分子机制具有积极的意义，也为OsSRFP1的育种利用提供理论依据。本研究还将利用基因组编辑技术创制敲除OsSRFP1基因的水稻抗冷新材料，应用于水稻育种实践。

本实验室前期从水稻中鉴定了一个编码RING型E3泛素连接酶的基因OsSRFP1，该基因受低温胁迫显著诱导。OsSRFP1抑制表达的转基因水稻材料显著提高了抗冷性，表明OsSRFP1是调节水稻低温响应的负调控因子。有意思的是OsSRFP1除了具有E3泛素连接酶之外，还具有转录激活能力。本项目主要围绕两个角度开展了研究。首先，分别采用了酵母双杂交和亲和纯化质谱分析的方法研究OsSRFP1的互作蛋白。以截断了RING结构域的OsSRFP1N蛋白为“诱饵”，通过酵母双杂筛选到两个MYB类的转录因子MYBR1和APL，并通过pull-down和BiFC验证了这两个蛋白确实和OsSRFP1互作。与此同时，获得了融合MYC标签的转基因植株OsSRFP1-6XMYC，通过亲和纯化质谱分析的方法筛选到两个酶类的蛋白：脯氨酸异构酶CYP及过氧化酶SPC分别与OsSRFP1互作，并进行了BiFC的验证。过量表达MYBR1的转基因水稻与野生型水稻相比，抗冷性得到了改善，这与OsSRFP1抑制表达转基因水稻在冷胁迫下的表型一致，说明MYBR1可能是作为OsSRFP1的底物发挥其功能。为了研究OsSRFP1的下游靶基因，采取了ChIP-seq的方法筛选和分析了OsSRFP1结合的DNA序列。用OsSRFP1-6xMyc转基因植株进行ChIP富集后，对所富集的产物建库与高通量测序，共计检测到4656个富集序列(Peaks)，其中990个片段是富集在对应基因启动子区域。对富集到的序列进行分析以对OsSRFP1可能结合的motif进行预测，预测获得的OsSRFP1的识别序列为富含G(GA)的短序列基序。将ChIP富集的基因与基因芯片挖掘的差异表达基因比较，发现Os06g0705400和Os06g0476200可能是OsSRFP1的下游靶基因。结合基因芯片、定量RT-PCR和瞬时表达实验，发现4个基因可能是OsSRFP1的直接或间接下游基因。此外，本项目获得了基因编辑OsSRFP1基因的水稻新材料。对OsSRFP1同源基因OsSRFP2进行了研究，发现其通过泛素化NAC类转录因子响应非生物胁迫。本项目系统研究了OsSRFP1在非生物胁迫条件下作为E3泛素连接酶或转录因子发挥作用的分子机制，为OsSRFP1及其信号通路中相关基因的育种利用提供了理论基础和新的基因资源。