E3泛素连接酶ZFRG1在水稻抗逆应答反应中的功能研究

锌指蛋白ZFP252基因过量表达的水稻转基因植株提高了耐盐和耐旱性。通过基因芯片技术鉴定了ZFP252的下游基因，其中ZFRG1基因在4个转基因株系中显著增强表达。ZFRG1编码1个具有RING结构域的E3泛素连接酶，其在水稻中的表达受低温、干旱和高盐的诱导，且其表达与ZFP252具有共线性。本研究拟进一步深入研究ZFRG1的功能。首先验证ZFRG1是否具有E3连接酶活性；凝胶电泳变动迁移率实验证实ZFP252是否与ZFRG1基因启动子直接互作以及互作的区域；研究ZFRG1基因在非生物胁迫下的诱导表达特性是否依赖于ZFP252以及ZFRG1是否在ZFP252介导的抗逆信号途径中是必须的；获得ZFRG1基因过量表达和RNA干涉的水稻转基因植株，对转基因植株进行表型和耐逆性分析；酵母双杂交技术鉴定ZFRG1互作的蛋白，分析可能的ZFRG1底物，阐明ZFRG1在水稻抗逆应答反应中的功能。

干旱、低温和高盐等非生物胁迫严重危害了作物的生长和生产。本项目前期工作中鉴定了受非生物胁迫诱导的水稻锌指蛋白基因ZFP252。ZFP252基因的表达受高盐和干旱胁迫的显著诱导，过量表达ZFP252基因的水稻转基因植株能够提高胁迫条件下脯氨酸和可溶性糖的积累，进而提高水稻耐盐和抗旱性。利用水稻原生质体瞬时表达实验技术证实了ZFP252具有转录抑制活性。通过基因芯片技术，比较了野生型水稻和ZFP252转基因水稻的转录组，鉴定了多个受ZFP252显著调节的下游基因，包括ZFRG1编码1个具有RING环锌指结构的锌指蛋白。RT-PCR和定量PCR实验证实了ZFRG1在ZFP252过量表达的水稻转基因植株的不同组织中表达量得到了显著增强，表明ZFRG1的确是ZFP252调控的下游基因。ZFRG1在水稻的各个组织中均有表达，在根和穗中的表达量较高，而在叶鞘中的表达量较低。ZFRG1表达受盐胁迫（100 mM NaCl）、渗透胁迫（20% PEG）、50 μM ABA、氧化胁迫（100 mM H2O2）、低温（4℃）、高温（42℃）、显著诱导。将ZFRG1:GFP于烟草叶片中瞬时表达，结果发现ZFRG1:GFP定位在细胞质膜。体外E3泛素连接酶活性分析实验结果表明ZFRG1具有E3泛素连接酶活性，且RING环结构域的完整性对ZFRG1的E3泛素连接酶活性是必需的。获得了过量表达ZFRG1和干涉抑制表达ZFRG1的水稻转基因植株，耐逆性实验结果表明，过量表达ZFRG1的转基因水稻耐盐和耐旱性有所下降，而RNAi转基因水稻的耐逆性得到了提高，表明ZFRG1是非生物胁迫的负调控因子。为了进一步研究非生物胁迫下ZFRG1的作用机制，利用酵母双杂交技术(Y2H)分析了ZFRG1的互作蛋白。通过Y2H技术，鉴定了8个水稻蛋白能够与ZFRG1互作，通过体外Pull-down技术验证了ZFRG1能够与两个胁迫相关的NAC转录因子互作，但是ZFRG1与ZFP252不能发生相互作用，表明ZFP252可能不是ZFRG1的泛素化底物。本研究初步提出了ZFP252通过调控一个E3泛素连接酶ZFRG1响应非生物胁迫的信号通路，为进一步研究ZFP252-ZFRG1介导的信号网络奠定了基础。