miRNA-96调控小Ras同源蛋白ARHI表达并依赖于Notch-1通路抑制胰腺癌上皮间充质转化与转移侵袭

Small Ras ARHI homologous protein plays important roles in cell proliferation, apoptosis and autophagy in pancreatic cancer. But the function and mechanism of ARHI in epithelial mesenchymal transition (EMT) of pancreatic carcinoma cells is not clear. Our previous studies showed that miRNA-96 bound with the 3 'UTR region of ARHI and negative regulated in its expression; positive correlation between ARHI expression and tumor staging, EMT and stemness level; ARHI promoted the invasion of pancreatic cancer cells in vitro and in vivo levels. This paper puts forward the hypothesis which is "MiRNA-96 regulates the expression of ARHI and relies on the Notch-1 pathway to inhibit epithelial mesenchymal transition and tumor invasion in pancreatic cancer", intends to explore: 1) ARHI is a downstream target gene of miRNA-96 and its expression is negatively regulated by miRNA-96; 2) ARHI promotes cell invasion and EMT in pancreatic cancer via a Notch-1-dependent pathway; 3) miRNA-96 inhibits EMT and cell invasion in pancreatic cancer by targeting ARHI. Therefore, this study established ARHI as a target for the treatment of pancreatic cancer, and established miRNA-96 as a new type of pancreatic cancer drug molecules, which has important theoretical significance and clinical value.

小Ras同源蛋白ARHI在胰腺癌中具有周期阻滞及抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡与自噬的作用，但其在胰腺癌上皮间质转化（EMT）及转移侵袭中的功能与机制尚不明确。本课题前期研究发现，胰腺癌细胞中，miRNA-96匹配于ARHI的3’UTR区域并负调控其表达；ARHI表达与肿瘤分期、EMT及细胞干性水平正相关；ARHI促进胰腺癌细胞体内外水平的EMT与侵袭。本课题提出“miRNA-96下调ARHI表达并依赖于Notch-1通路抑制EMT与肿瘤侵袭”的假说，拟探讨：1）miRNA-96以ARHI为下游靶基因负调控其表达；2）ARHI依赖于Notch-1通路促进体内外水平的胰腺癌细胞EMT与侵袭；3）miRNA-96通过ARHI介导抑制胰腺癌细胞EMT及转移侵袭。由此，本课题确立ARHI为胰腺癌治疗靶点，确立miRNA-96为新型胰腺癌药物分子，具有重要的理论意义与临床价值。

胰腺癌是一种恶性程度很高，诊断和治疗都很困难的消化道肿瘤，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势。主要原因在于胰腺癌早期症状不明显，缺乏灵敏性高特异性强的早期诊断手段，恶性程度高，手术切除率低，特别是侵袭转移强是胰腺癌高死亡率的重要影响因素。EMT现象主要特征是上皮细胞表型的丧失与间质特性的获得，而且EMT是肿瘤发生发展过程中的重要现象，不仅有助于癌症细胞的早期传播，更是恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程，是细胞维持干性的重要因素。小Ras同源蛋白ARHI在胰腺癌中具有周期阻滞及抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡与自噬的作用，但其在胰腺癌上皮间质转化及转移侵袭中的功能与机制尚不明确。本实验旨在研究ARHI表达与胰腺癌细胞EMT及细胞干性标志蛋白表达相关性，并探讨ARHI介导EMT与细胞干性的功能与分子机制。. 本课题首先通过免疫组化检测ARHI在不同进展的胰腺癌中，以及在转移与非转移性胰腺癌中的差异表达；其次，在不同分化程度的胰腺癌细胞中通过蛋白免疫印迹检测ARHI与EMT蛋白表达水平的相关性，并改变内源性 ARHI 表达后从蛋白和mRNA水平探讨了细胞 EMT标志蛋白表达的变化；再次，通过Transwell检测细胞迁移能力、扫描电镜检测伪足与绒毛形成、以及共聚焦检测细胞干性微球体形成能力，明确ARHI在胰腺癌细胞EMT与侵袭相关生物学行为中的作用。同时对裸鼠进行脾脏注射构建肝转移模型，进一步验证ARHI对体内胰腺癌细胞迁移侵袭的影响。最后，应用ERK信号通路抑制剂U0126处理后，通过蛋白免疫印迹检测ERK磷酸化、EMT及细胞干性水平。. 本课题表明ARHI表达与胰腺癌细胞恶性度正相关，与胰腺癌细胞EMT及细胞干性水平正相关；ARHI促进胰腺癌细胞EMT相关表型，如细胞微绒毛及伪足形成，微球体形成及侵袭迁移；ARHI对胰腺癌细胞EMT及细胞干性的促进效应并不完全依赖ERK通路，还与关键蛋白Notch-1的表达密切相关。由此，本课题揭示了ARHI促进胰腺癌细胞EMT及细胞干性的功能，并初步探明相关分子机制。