运用“多组分印迹敲除”策略高通量筛选苗药黑骨藤孕甾糖苷免疫抑制组分的研究

Periploca forrestii Schltr. which is Miao Ethnomedicine, often is used to treat rheumatism, rheumatoid disease and so on by people in Southwest China. This herb shows significant immunosuppressive activity. But, it has complicated active ingredients and the material foundation has not been clarified thus far. Because of its ability of clarifying the complicate pharmacological relationship between multiple active constituents of natural medicine quickly and accurately, “Constituent Knock-out” method which is a novel method for clarifying the material foundation of traditional Chinese medicine had been paid more and more attention. But, this method cannot be used widely for the reason of poor separation between molecules with similar physical and chemical properties by this method. This problem just can be fixed by “Molecule Impringting” technology which stem from immunology. Thus, “Multi-constituent Imprinting & Knock-out” strategy is proposed by us now. The point of this strategy is high-throughput screening active constituents from natural medicne using both of frontier theories. According the references, pregnane glycosides are chosen as the research object in this project, and it will be attempt to figure out the effect of such compounds on immuno suppressing by “Multi-constituent Imprinting & Knock-out” strategy in order to promote the final elucidation of the material foundation of Periploca forrestii Schltr.. Providing a efficient method for the material foundation study of the natural medicine is another aim of this project.

苗药黑骨藤被西南人民用于风湿、类风湿等疾病的治疗，具有明显的免疫抑制活性，但该药物活性成分复杂，至今其物质基础仍未被阐明。由于能够快速准确地厘清天然药物多活性组分之间复杂的药效关系，近年来“成分敲除”这种新的物质基础研究方法逐渐受到重视。但是到目前为止，其相关的研究尚不能根本解决理化性质相近分子的分离问题，阻碍了这种方法广泛地应用。源于免疫学的“分子印迹”技术恰好可以弥补这个缺陷。因此，本项目创新性地提出“多组分印迹敲除”的策略，尝试将“成分敲除”和“分子印迹”两种前沿理论结合来实现天然药物多活性组分的高通量筛选。根据文献，本项目选择黑骨藤中的孕甾糖苷类化合物作为研究对象，拟通过“多组分印迹敲除”策略研究其在免疫抑制中的作用，以期为黑骨藤物质基础的全面阐明提供理论依据和实践经验，并为其他天然药物物质基础的研究提供一种高效的研究方法。

本项目以苗药黑骨藤为研究对象，主要研究目的为探索其中重要的免疫抑制组分和黑骨藤的主要药理学机制。本项目采取分子印迹技术结合分子敲除策略来进行，主要研究内容包括：“建立黑骨藤有效成分含量检测预测方法”、“应用免疫色谱法和分子敲除策略验证杠柳苷在黑骨藤中的免疫抑制作用”、“印迹聚合方法筛选及验证实验”、“黑骨藤孕甾糖苷印迹聚合物制备及应用实验”和“黑骨藤孕甾糖苷活性成分免疫抑制机制研究”。研究发现：第一、建立了黑骨藤药材的齐墩果酸含量的预测模型；第二、分子印迹实验筛选出了糖苷类化合物印迹聚合物最佳的聚合方法是溶液聚合，最佳的聚合单体是丙烯酰胺，最佳印迹聚合物形态是水凝胶；第三、通过将上述分子印迹方法用于杠柳苷的印迹并敲除黑骨藤提取物中杠柳苷，其后的免疫细胞增殖实验明确了杠柳苷是黑骨藤中重要的免疫抑制成分；第四、通过上述分子印迹方法对糖苷类化合物的分子共性部分进行印迹，实现了黑骨藤中多组分的敲除，明确了除了杠柳苷仍然存在其他影响黑骨藤免疫抑制作用的糖苷成分，但影响作用较杠柳苷弱；第五、黑骨藤活性化合物在体内的递送所需时间可能较长，可能造成黑骨藤的治疗时间较长；第六、黑骨藤中的免疫抑制成分在体内的运送可能是通过与生物大分子结合之后实现的，这也可能是黑骨藤起效较慢的原因；第七，黑骨藤除了免疫抑制作用还有显著的抗炎作用。除此之外，在保证主要研究内容完成的基础上，本项目还进行了多项扩展研究，涉及天然药物栽培条件和跨领域应用等多项内容，获得了以下成果：第一、总黄酮中槲皮素占比适合做黑骨藤药材的地区区分指标，这一指标受降水量影响，更低降水量更利于提高该指标；第二、银纳米粒子可以通过黑骨藤水提液制备，该纳米粒子具有低细胞毒性的特点。本项目创新了天然药物活性成分的筛选方法，演示了材料学与传统药学的新结合，项目的完成有利于黑骨藤的临床应用和市场开发，也拓宽了材料学的应用范围。