基于同位素代谢标记和定量代谢组学的甲基化代谢谱定量分析方法研究

Aiming of the methylated metabolites which have been found closely related to cancer in the previous research work, this project is preparing to build the qualitative and quantitative LC-MS method to investigate the methylation metabolites in plasma by stable isotope metabolic technique and quantitative metabolomics method. The object of this research will be focus on human breast cancer cells in nude mice xenograft tumor model and the main methyl group donor methionine. The methylation metabolites labeled by 13C-methionine will be identified by ultra-high performance liquid chromatography combined with high resolution mass spectrometry. On this basis, by using the stable isotope labeling techniques and quantitative metabolomics research strategy, the overall quantitative methods of methylated metabolites in plasma will be established combined with bioinformatics methods. Finally, the potential biomarkers closely related to breast cancer’s occurrence and development will be screened by comparing each methylated metabolites in plasma detected in the control group and model group. The methylation pathway disorder discovered in breast cancer will also be investigated. The established new quantitative method for methylated metabolites will be significant in the discovery of new biomarkers related to cancer development, clarification of the pathogenesis of cancer, as well as the diagnosis and treatment of other diseases.

本项目针对发现的与癌症密切相关的甲基化代谢物，采用稳定同位素标记技术和定量代谢组学方法，拟开展基于LC-MS技术的血浆中甲基化代谢物的整体定性与定量分析方法研究，以实现不同病理状态下甲基化代谢谱的定量分析。选择人乳腺癌细胞裸鼠异体移植瘤模型为研究对象，以体内主要的甲基供体蛋氨酸为切入点，采用超高效液相色谱-高分辨质谱联用技术，对甲基13C标记的蛋氨酸代谢标记后的甲基化代谢相关产物进行识别和结构鉴定。在此基础上，采用稳定同位素标记技术和定量代谢组学研究策略，结合生物信息学方法，建立血浆中甲基化代谢物的整体定量分析方法。进一步通过检测对照组和乳腺癌模型组的各甲基化代谢物含量，筛选与乳腺癌发生、发展相关的小分子生物标志物，探索乳腺癌在甲基化代谢途径上可能发生的紊乱。本项目旨在建立甲基化代谢谱定量分析新方法，该方法为发现新的癌症发生发展生物标志物，阐明癌症发病机制，并对疾病诊疗具有重要意义。

本项目针对本实验室近年来临床肿瘤代谢组学研究中发现的一系列与甲基化相关的代谢物的异常变化，拟建立血浆中甲基化代谢谱的整体定性与定量分析方法，并将其应用于乳腺癌模型动物的代谢组学研究中。本项目针对该研究目标，首先通过比较不同血液样本采集方法对代谢组学研究和甲基化代谢物的提取影响，考察了临床常用的柠檬酸钠、EDTA-K2、肝素钠、肝素钾、草酸钾等抗凝的血浆样本中代谢组的差异，最终选择了肝素抗凝的血浆样本。然后，针对血浆中的甲基化代谢物建立了甲基化代谢物的靶向与非靶向同步定量代谢组学分析方法。该方法不仅可定量研究包含甲基组氨酸、甲基黄嘌呤、甲基尿嘧啶等20个甲基化代谢物的129个与癌症密切相关的可能生物标志物，还可实现血浆中同时检测血浆中1324个代谢物，实现了1015个代谢物的半定量分析。将该方法应用于MDA-MB-231乳腺癌裸鼠异体瘤模型的甲基化代谢谱和代谢组学研究中，获得了15个与乳腺癌模型中有显著性变化的代谢物， 6个代谢物N2-甲基鸟苷、脯氨酸、色氨酸、8-羟基-2’-脱氧鸟苷、牛磺酸和黄嘌呤核苷为乳腺癌的潜在生物标志物，提示MDA-MB-231乳腺癌模型裸鼠体内可能发生了色氨酸代谢紊乱和蛋白质分解为氨基酸的过程增强。其中，与甲基化相关的代谢物N2-甲基鸟苷和牛磺酸均发生了较大的变化，该结果也与前期的临床乳腺癌血浆代谢组结果一致，提示甲基化代谢异常与乳腺癌具有较大的相关性，N2-甲基鸟苷和牛磺酸可能成为乳腺癌的生物标志物。后面将进一步采用同位素示踪法对细胞中的一碳循环关键代谢物的含量变化进行研究，以验证上述研究结果。