茶叶EGCG-O-甲基转移酶的分离纯化及基因克隆研究

甲基儿茶素EGCG3"Me是茶叶中具有抗过敏作用的生理活性成分。我们前期研究表明，茶鲜叶中存在EGCG-O-甲基转移酶，可催化EGCG生成EGCG3"Me；该酶的活性与茶树种质、茶鲜叶成熟度等密切相关。但目前国内外对茶叶中EGCG-O-甲基转移酶尚无深入研究。本项目拟通过对该酶进行分离纯化、基因克隆和酶特性等研究，获得高纯度的EGCG-O-甲基转移酶，完成EGCG-O-甲基转移酶的基因序列测定，查明EGCG-O-甲基转移酶的特性。所获结果对进一步阐明茶树体内儿茶素的次生代谢，了解茶叶中EGCG3"Me的形成机制，指导今后利用酶工程开发具有抗过敏功能的天然药物具有重要的理论意义和实际应用价值。

甲基儿茶素EGCG3"Me是茶叶中具有抗过敏作用的生理活性成分。我们前期研究表明，茶鲜叶中可能存在EGCG-O-甲基转移酶，可催化EGCG生成EGCG3"Me，该酶的活性与茶树种质、茶鲜叶成熟度等密切相关。但目前国内外对茶树儿茶素类O-甲基转移酶尚无深入研究。本项目针对茶树EGCG-O-甲基转移酶，系统进行了基因克隆、诱导目的蛋白表达、分离纯化和催化活性等方面研究；此外，还初步开展了茶树中类黄酮O-甲基转移酶的基因克隆、表达等研究。取得了以下重要研究结果：①采用RT-PCR及基因克隆测序等手段从特异茶树种质TRI-002的鲜叶中获得了一种甲基转移酶基因的cDNA编码序列（该序列长度为738bp，编码245个氨基酸）；并得到了该甲基转移酶的基因组DNA序列（长度为2678bp，包括4个内含子和5个外显子）。②实时荧光定量PCR分析表明，所获基因的表达量随着叶片成熟度的增加而提高，与甲基儿茶素在不同成熟度鲜叶中含量的检测结果一致，说明该基因与茶树体内甲基化儿茶素的生物合成有关。③重组表达载体在大肠杆菌BL21（DE3）Plays中得以诱导表达，其产酶量最佳培养条件：诱导剂IPTG终浓度为0.05mmol/L、诱导时间为20-24h、培养基pH为6.5、温度为20℃。④采用His-Trap亲和蛋白层析柱等对粗酶液进行纯化，纯化后酶液蛋白浓度为21.32mg/ml，反应体系中EGCG3〞Me含量最高可达到578μg/ml；且发现该酶在温度为35℃，pH为7.5， Mg2+浓度为2mmol/L时，催化活性较高，其米氏常数Km=0.100mM，Vmax=7.485 mg/(L.min)。⑤LC-MS分析发现，该酶可催化EGCG生成10多种EGCG甲基化衍生物，主要包括EGCG3〞Me、 EGCG4〞Me、EGCG3〞,4〞-diMe、EGCG3〞5〞-diMe等。⑥从茶树叶片中克隆得到另外两个类黄酮O-甲基转移酶基因（CsOMT-1和CsOMT-2）的cDNA全长，并在大肠杆菌中得到了高效表达，初步测定了其催化EGCG的活性。本研究结果为进一步了解茶叶中甲基儿茶素的形成机制奠定了基础，对于今后利用酶工程开发具有抗过敏功能的天然药物具有重要的指导意义和实际应用价值。