家蝇抗病毒蛋白的分离纯化、基因克隆表达及功能分析研究

昆虫通过体液和细胞免疫对入侵病原微生物如细菌、病毒等作出有效免疫防御反应，对细菌的免疫目前已有比较深入的了解，但其对病毒的防御和控制的研究报道较少。前期试验中，申请者从家蝇中纯化出一种对BmNPV和AcMNPV两种昆虫病毒具有显著抗性的单一蛋白组分HAP。在此基础上，本项目拟对前期研究中的抗病毒蛋白粗样进一步分离纯化，以期获得更多种抗病毒蛋白因子；采用分子技术克隆家蝇抗病毒基因cDNA全长序列，并通过体外重组、转化、转染技术在家蚕Bac-to-Bac高效基因表达系统中大量表达，Ni-NTA柱亲和层析后验证其活性功能；采用荧光定量PCR技术探明抗病毒基因在家蝇发育中的时空表达模式，并利用光谱分析技术对蛋白分子构象进行初步解析。研究结果有助于深入揭示包括家蝇在内的昆虫抗病毒免疫生理生化机制，进一步丰富和完善昆虫免疫防御体系理论，也为后续培育新型高抗病家蚕种质资源和潜在的医药应用提供基础性资料。

昆虫缺乏适应性免疫机制，主要通过体液和细胞免疫对入侵病原微生物作出有效免疫防御反应，对细菌的免疫目前已有比较深入的了解，但其对病毒的防御和控制的研究报道较少。项目组完成了家蝇幼虫转录组测序分析工作，在此基础上筛选获得了多种抗病毒目的基因序列，通过RT-PCR、原核表达、亲和层析纯化等分子生物学技术对家蝇免疫因子MdCTL1，MdCTL2、MdomSP1、MAF-1A和几丁糖的抗病毒免疫活性进行了功能验证。蛋白序列比对显示，MdCRL1-2与多种双翅目昆虫C型凝集素具有较高的序列相似性，均具有C型凝集素典型的CRD结构域；荧光定量PCR结果显示，MdCTL1和MdCTL2基因在家蝇不同发育阶段的表达具有显著差异性，在家蝇从1龄幼虫到蛹的过程中，MdCTL1，MdCTL2的表达量逐步上升，直至蛹期达到最大值；MdomSP1的转录水平在不同虫态及虫龄之间差异也较大，以末龄幼虫的最高，转录水平随着虫龄的增长而上升，在末龄幼虫时达到高峰，而在蛹期有所下降；构建重组载体，通过原核表达，Ni-NTA柱亲和纯化目的蛋白包涵体，变性复性后分别测定了MdCRL1、MdCRL2和MdomSP1蛋白的抗菌凝集活性及对AcMNPV和流感病毒H1N1的抗病毒活性。抗病毒试验结果表明，与病毒对照组相比，MdCRL1、MdCRL2和MdomSP1处理组的TCID50值降低数十倍，显示MdCRL1、MdCRL2和MdomSP1对AcMNPV均具有明显的抗性，而且MdomSP1对流感病毒H1N1也具有显著的灭活作用。而且，凝集试验结果表明，MdCRL1-2对革兰氏阴性菌E. coli和革兰氏阳性菌S. aureus均显示出较强的凝集活性，并呈现Ca 2+依赖性，序列分析显示Ca 2+依赖性与MdCRL1-2分别具有WND和QPD结构位点相关。此外，通过多肽合成技术获得了家蝇短肽MAF-1A的高纯度样品，研究发现其对AcMNPV和BmNPV病毒也具有显著抗性。除家蝇体内存在多种抗病毒因子外，其体表几丁质中存在的几丁糖也显示出较强的抗病毒、抗氧化和抗真菌活性。上述研究表明，MdCTL1，MdCTL2、MdomSP1、MAF-1A和几丁糖可能在家蝇幼虫体内体表发挥不同的抗病毒免疫功能。项目的完成不仅有助于深入揭示家蝇抗病毒免疫机制，也为后续抗病毒因子潜在的医药应用提供基础性资料。