ALKBH5-ADAR1-UBE2C轴抑制细胞自噬在NSCLC顺铂耐药中的作用及机制研究

The drug resistance seriously limits the application of chemotherapeutic drugs in non-small cell lung cancer treatment. Some research showed that ADAR1 can affect the proliferation and drug sensitivity of tumor cells. Our previous studies had found that the expression levels of ADAR1 and ALKBH5 in lung cancer tissues and drug-resistant cells were significantly up-regulated. ALKBH5 inhibited the m6A methylation level of ADAR1 mRNA and promoted its expression. ADAR1 regulated UBE2C expression and inhibited autophagy and chemotherapy. However, ALKBH5 demethylated ADAR1 mRNA to regulate UBE2C expression, and then affected autophagy and chemotherapy sensitivity in NSCLC cells, which had not been reported until now. We used lung cancer cells and mouse tumor bearing model to explore this mechanism in vivo and in vitro as follows: 1) Analysis the biological functions of ALKBH5, ADAR1 and UBE2C in the occurrence of lung cancer; 2) Explore the molecular mechanism of ALKBH5 demethylate ADAR1 mRNA to affect its stability; 3) Clarified the function of autophagy in ALKBH5-ADAR1-UBE2C signaling axis regulating DDP resistance. The successful implementation of this project will provide theoretical and experimental basis for further clinical treatment of non-small cell lung cancer basing on ALKBH5-ADAR1-UBE2C signal axis.

耐药性的产生严重限制了药物在非小细胞肺癌治疗中的应用。有研究表明，ADAR1能够影响肿瘤细胞的增殖和对药物的敏感性。我们前期研究发现肺癌组织及耐药细胞中ADAR1、ALKBH5的表达水平均显著上调，ALKBH5能够抑制ADAR1 mRNA的m6A甲基化水平并促进其表达，并且ADAR1调控UBE2C表达并抑制细胞自噬和对化疗药物的敏感性，但ALKBH5通过ADAR1调控UBE2C在细胞自噬及化疗抵抗中的机制尚不明确。为阐明这一机制，本课题拟利用肺癌细胞和小鼠荷瘤模型通过体内外实验开展以下研究：1）研究ALKBH5、ADAR1、UBE2C在肺癌发生中的生物学功能；2）探讨ALKBH5通过去甲基化修饰ADAR1 mRNA影响其表达水平的分子机制；3）阐明ALKBH5-ADAR1信号轴通过调控UBE2C抑制细胞自噬在化疗耐药中的作用机制。本项目的顺利开展将为非小细胞肺癌的临床治疗提供理论依据。

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，已成为癌症相关死亡的头号杀手，严重危害人类的健康。目前，肺癌治疗策略主要是以铂类为基础的化疗方法，其中顺铂是治疗晚期肺癌的一线药物之一。手术后复发及晚期肺癌具有高侵袭性、预后不良等特性，且极易对药物产生耐药。越来越多的证据表明，m6A甲基化修饰在细胞多种生理过程中发挥重要作用，也与多种疾病尤其是癌症的发生密切相关。ALKBH5作为细胞内调控RNA修饰的重要因子，在肿瘤的发生发展中发挥重要作用，但其在肺癌发生发展及化疗耐药中的作用和机制尚不明确。课题组在NSCLC细胞中过表达或敲低ALKBH5，分别通过Dot Blot、CCK8、克隆形成和Transwell实验发现，ALKBH5显著抑制细胞内RNA的m6A修饰水平并促进NSCLC细胞的恶性生物学行为（增殖、克隆形成、迁移及浸润等），裸鼠皮下异种移植瘤实验也证明，ALKBH5可以促进体内NSCLC细胞的增殖以及肺转移；通过RT-qPCR及Western Blot实验证实ALKBH5显著促进ADAR1 mRNA及蛋白的表达水平；MeRIP-PCR实验表明，ADAR1 mRNA上存在m6A修饰，并且ALKBH5可以与ADAR1的mRNA发生相互作用，并减低其m6A修饰的水平；通过数据库预测，并经实验验证发现，ALKBH5主要作用于ADAR1 mRNA的终止密码子附近的m6A修饰基序；CCK8、流式细胞术及裸鼠皮下异种移植瘤实验表明，过表达ALKBH5可以显著抑制细胞对DDP的敏感性，并抵抗DDP对细胞的杀伤作用，且ADAR1在ALKBH5诱导的DDP抵抗中发挥重要作用。通过研究工作的开展明确了ALKBH5对非小细胞肺癌恶性生物学行为（增殖、克隆形成、迁移及浸润等）及顺铂耐药中的影响，并深入研究了ALKBH5调控ADAR1表达的分子机制，探讨了ADAR1在ALKBH5调控的NSCLC恶性生物学行为及顺铂耐药中的作用，丰富了ALKBH5促进肿瘤进展及化疗耐药的分子调控网络，为临床靶向ALKBH5治疗NSCLC及逆转顺铂耐药提供了理论依据和实验基础。