通过Wnt/β-catenin信号调控1-EMT促进小鼠ESCs向肝脏组织结构分化的机制

Until now, the hepatic differentiation of embryonic stem cells (ESCs) usually results in single cell lineage and could not form liver tissues. It is found that the too fast type 1 epithelial-mesenchymal transition (1-EMT) in late stage of ESCs differentiation is the major reason. 1-EMT is regulated by Wnt/β-catenin signal in normal tissues. However, recent studies showed that cellular autocrine signal can maintain a stable Wnt/β-catenin balance, and then regulate the stability of 1-EMT in vivo. Recently, we found that Wnt/β-catenin and 1-EMT levels decreased and then the differentiating hepatocytes can form a 3D status with vessel structures in a E-cad high expressed ESCs differentiation system. However, its mechanism is still unclear. We therefore want to use sFRP-1 in a in vitro ESCs differentiation system to mimic the in vivo cellular autocrine signal, which inhibits Wnt/β-catenin and dynamically regulates 1-EMT and then promotes hepatic tissue differentiation. Furthermore, we hope to find the regular patterns and evidences that Wnt/β-catenin mediated 1-EMT promotes ESCs to differentiate into hepatic tissue, and then obtain a new liver function substitute and a theory update in ESCs differentiation mechanisms.

我们前期研究提示，胚胎干细胞（ESCs）向肝脏方向分化中，细胞1型上皮间质转化（1-EMT）水平过快是分化肝细胞呈单细胞状态而不能形成肝脏组织结构的主要原因。最近表明，体内以细胞自分泌蛋白调节Wnt/β-catenin信号进而调控1-EMT于稳定水平以维持机体组织的稳定性。我们预实验发现ESCs分化中Wnt/β-catenin信号抑制后，可降低细胞1-EMT水平并使其保持三维状态生长，提示可能有促进组织形成的作用，但进一步效果及机制不明。为此，本课题拟：①利用细胞自分泌蛋白sFRP-1等抑制Wnt/β-catenin信号，降低1-EMT以促进ESCs向肝脏组织结构分化；②研究其中β-catenin通过影响Snail等表达而调控1-EMT的机制，以及调控肝实质、间质细胞同步分化和增强细胞黏附而促进肝组织形成的机制。本课题旨在获得一种更高水平的肝功能替代物，并促进ESCs分化机制的完善和更新。

课题前期发现ESCs分化中Wnt/β-catenin信号抑制后，可降低细胞EMT水平并使ESCs保持三维组织状态生长，为进一步研究可否具体形成肝脏组织及其及机制，本课题主要研究了以下内容：首先，我们利用肝系细胞因子TGF、FGF、HGF等诱导ESCs体外向肝系细胞方向分化，在ESCs分化的EBs期、肝细胞分化早期、分化中期、分化成熟期，用QPCR技术等检测EMT水平的动态表达差异；然后利用分泌型卷曲相关蛋白1 (sFRP-1)在肝细胞分化中、后期抑制Wnt/β-catenin信号通路并动态的调控降低EMT水平，促进分化的肝细胞、BECs和血管等间质成分共同形成肝脏组织；最后，实施肝脏组织结构的鉴定以及研究上述过程中EMT水平与肝脏组织形成的相互关系及机制。研究结果我们发现：（1）通过Wnt/β-catenin信号在ESCs分化中后期动态降低EMT水平，可成功诱导小鼠ESCs分化为类肝脏组织；（2）在ESCs向肝脏组织分化过程中，验证了通过Wnt/β-catenin调控EMT而促进ESCs向肝脏组织分化的作用方式，分析发现了EMT在ESCs分化中后期适当降低水平可促进体外组织结构形成的机制，这种机制与体内胚胎组织发育机制类似，以及肝系细胞，血管等间质成分共同形成肝脏组织的机制。关键的实验数据包括了检测到各种肝组织标记物（如AFP、ALB、CK8、CK19等）、血管细胞标记物（VEGFR-1、CD31等）的表达，ALB、尿素合成，类血管结构以及类肝小叶结构的形成，还总结了EMT动态水平与肝脏组织形成的动态规律及相关机制。最后，我们将诱导小鼠胚胎干细胞分化得到的类肝脏组织注射到小鼠肝脏，发现能在小鼠肝脏内良好生长，无肿瘤形成。课题实施基本完成了预期目标，在后续研究中，将对这种新型的肝功能替代物进一步鉴定，提高其分化效率，促进在肝功能衰竭治疗中的应用。