利用转基因斑马鱼研究abcb4基因在肿瘤耐药中的机制

Multidrug resistance is the main cause of failure of tumor therapy, so based on Multidrug resistant mechanism to establish an ideal animal model has important value for anti-tumor drug development and clinical preliminary screening. ATP binding cassette transporter protein (ABC) in MDR1 is mediated by drug efflux, resulting in the development of multidrug resistance in cancer drug which is the reason why MDR1 is a key factor in the multidrug resistance in cancer. At present, research on Mdr1a-/- gene knockout mice, unable to realize the expression induced by MDR1, and can only be used for the study on the mechanism of drug resistance, and cannot become resistant drug screening model. Our research group take full advantages of zebrafish's unique biology and genetics advantages, namely the regulation network of development and human highly conserved, embryo development in vitro and transparent, can be directly dynamic monitoring in the whole developmental process, high throughput, small molecule drugs reflect the screening of small volume, easy absorption and relative economy, conbining with sing the tracer transgenic zebrafish technology, and establish the MDR1 transgenic model of EGFP markers in zebrafish, inducing the expression of MDR1 to investigate the mechanism of MDR1 on multidrug resistance. We may further elucidate the mechanisms of tumor multidrug resistance, in order to establish an ideal animal model which could be used for drug screening, and provides an important basis to pre clinical for drug screening.

多药耐药是导致肿瘤药物治疗失败的主要原因，基于多药耐药机制建立理想动物模型对于抗肿瘤药物的开发和临床前期筛选具有重要价值。ATP结合盒转运蛋白家族（ABC）中的MDR1（P-gP/ABCB1）主要介导药物的外排，从而导致肿瘤药物发生多药耐药，是肿瘤耐药中的关键因素。而目前研究常用的Mdr1a-/-基因敲除小鼠，无法实现诱导性MDR1的表达，遂只能用于肠道主动运输方面的研究，而无法成为耐药药物筛选的模型。本课题利用斑马鱼独特的生物学和遗传学优势，拟建立一个abcb4特异性启动子驱动egfp基因的转基因动物Tg(abcb4:EGFP)模型，通过药物诱导MDR1的表达，深入探讨MDR1在多药耐药中的机制，进一步阐明肿瘤产生多药耐药的可能机制，以填补高通量的、活体的、多药耐药筛选动物模型的空白，对于临床抗肿瘤新药的筛选，具有重要的科学价值和巨大的应用前景。

从NCBI网站获取不同物种（斑马鱼、人类、小鼠等）abcb4基因及其编码蛋白质序列的相关信息，进行同源性比对和SYNTENY分析。从生物信息学的角度判断斑马鱼abcb4基因与人、小鼠的多药耐药基因abcb1的同源性。利用原位杂交实验，检测不同发育阶段的野生型斑马鱼abcb4基因表达谱，以期确定abcb4基因在斑马鱼中正常的表达模式。用已知的常用肿瘤耐药药品，作用不同阶段野生型斑马鱼，通过real-timePCR和全胚胎原位杂交的方法，建立耐药后p-gp表达谱分析。预测并克隆的斑马鱼abcb4的启动子区，利用荧光报告素酶系统，在细胞水平上对该启动子测效。测效完成后，为示踪斑马鱼体内p-gp的表达细胞，用特异性abcb4启动子驱动绿色荧光蛋白基因（EGFP），利用tol2转基因系统，通过显微注射，最终建立稳定的、可示踪的、在abcb4启动子特异性驱动egfp的纯合子系。用易发生肿瘤耐药的药品（如长春新碱、阿霉素等）诱导转基因系，观察模型动物EGFP表达情况，并在荧光强度、mRNA水平和蛋白水平上EGFP的变化。同时，确定对胚胎期及成体不同发育阶段abcb4启动子特异性驱动egfp的“绿色细胞”细胞进行表型分析、细胞生物学及分子机制研究。观察和分析药物诱导前后，对该“绿色细胞”的结构和功能的影响。共聚焦显微镜结合胚胎免疫荧光技术直观动态监测“绿色”细胞的行为。流式细胞仪分选出高纯度的绿色“不同发育阶段的细胞”，抽提其DNA、RNA和蛋白，采用原位杂交、Western Blot、共聚焦显微镜以及膜蛋白质芯片等技术开展，耐药发生前后与酶结构、细胞功能受损的关系的研究。在国际上首次建立稳定、可示踪、连续和动态观察的高通量的、活体的、多药耐药筛选动物模型，为开展多药耐药研究以及深入全面揭示p-gp分子和多药耐药的机制，为抗肿瘤新药研发提供理想的动物模型,改变以往多药耐药体内研究的困难局面；首次活体动态地进行abcb4基因功能的研究及鉴定，确立abcb4在多药耐药机制的发生中的关键性，并且成功构建出转基因系斑马鱼的筛药模型，证实此模型的可行性，为进一步在临床工作中进行大量药物筛选工作提供有效工具。