利用转基因斑马鱼研究cdh5基因对胚胎期造血发育的影响及其与hoxb4基因的调控关系

Hematopoietic stem cell transplantation is the most effective method for the treatment of hematological malignancies，but less source of hematopoietic stem cells, difficulty of amplification,  It is one of the bottlenecks to limit the clinical application of this therapy. Therefore, the hematopoietic developmental regulation mechanism is studied in depth. Hematopoietic stem cells are derived from hemangioblasts, and with the development of embryos, the hematopoietic site is changed. Different levels of hematopoietic stem cell surface antigen, immunophenotype and adhesion molecules have a certain degree of difference.Cdh5 expression in hemangioblasts, vascular stem cells and hematopoietic stem cells, the expression and function pattern similar to hematopoietic development positive regulation factor hoxb4 height. A certain concentration of Hoxb4, amplification effectively HSC without affecting its differentiation.Our previous studies found that cdh5 with hoxb4 expression level mechanism has a high degree of correlation.Zebrafish embryo development in vitro, transparent, can be directly dynamic monitoring of hematopoietic development process, hematopoietic regulation network and human highly conservative characteristics,this subject intends to research the function of cdh5 in the process of hematopoietic development, clarify the regulation between hoxb4 and cdh5,by transgenic zebrafish. provide a theoretical basis for the effective expansion of hematopoietic stem cells.

造血干细胞移植是治疗恶性血液病最有效的方法，但造血干细胞来源少、扩增困难，成为限制该疗法临床应用的瓶颈之一，因此持续深入的研究造血发育调控机制，实现有限来源造血干细胞的有效扩增就尤为必要。造血干细胞来源于成血成血管干细胞，随着胚胎发育，不停的变换造血位点。不同分化水平的造血干细胞表面抗原、免疫表型和粘附分子的均有一定程度的差异。Cdh5既表达在成血成血管干细胞，又表达于血管干细胞和造血干细胞，表达量和作用模式与造血发育正向调控因子hoxb4高度相似。一定浓度的Hoxb4，能有效扩增HSC而不影响其分化。本课题组前期研究发现cdh5表达水平与hoxb4作用机制有高度的关联性，本课题拟利用斑马鱼胚胎体外发育、透明，可直接动态监测造血发育过程、造血调控网络与人类高度保守的特点，研究cdh5在造血发育过程中的功能，明确其与hoxb4的调控关系，为有效扩增造血干细胞提供理论基础。

本项目期间课题组分析了斑马鱼cdh5基因序列信息，选取特异性基因片段进行克隆，构建了重组质粒，并通过全胚胎全胚胎原位杂交的方法获得了野生型斑马鱼cdh5基因mRNA的表达谱。克隆cdh5基因序列编码区序列，构建重组表达质粒，体外转录后利用显微注射的方式导入单细胞期斑马鱼胚胎，通过瞬时高表达cdh5，研究其对野生型斑马鱼胚胎期造血发育的影响，研究发现野生型斑马鱼胚胎原始造血和定向造血均有正向调节作用。在特异性高表达hoxb4的转基因斑马鱼胚胎造血组织通过全胚胎原位杂交技术发现cdh5mRNA信号丰度明显强于对照组；分选型不同时间点特异性高表达hoxb4的转基因斑马鱼胚胎造血组织细胞和对照组细胞，研究发现在不同时间点特异性高表达hoxb4的转基因斑马鱼胚胎造血组织细胞cdh5mRNA较对照组均显著增加，表明高表达hoxb4后，cdh5的表达也增加，同时高表达cdh5也表现出正向的造血调控作用，表明cdh5可能是hoxb4的下游靶基因，是否是直接下游靶基因尚需进一步研究。本课题执行期间内，共为2名博士研究生，1名硕士研究生，3名本科生提供了科研训练机会；已发表研究论文5篇，其中北图核心期刊论文3篇，统计源科技核心期刊论文2篇，2篇SCI收录期刊论文正在投稿中。