应用转基因斑马鱼研究同源盒基因HOXB4在造血干细胞发育调控中的分子机制

造血干细胞(HSC)移植是临床治疗血液系统疾病、实体瘤、免疫缺陷病等疾病的重要措施。其供体来源十分缺乏，严重制约了HSC移植的应用。扩增HSC 是移植治疗的一个重大挑战，如何使HSC在体内外扩增同时保持自我更新特性更是一个亟待解决的难题。hoxb4 基因是造血细胞分化早期的重要调控因子, hoxb4 蛋白目前被认为是最有潜力的干细胞扩增工具之一。因此，本课题利用斑马鱼独特生物学和遗传学优势，即胚胎体外发育而且透明,可直接动态监测造血发育全过程，便于进行细胞生物学研究，造血调控网络与人类高度保守等特点，遂建立可示踪的HSC自我更新的斑马鱼模型，在斑马鱼体内时-空特异性过表达hoxb4基因，进一步探讨hoxb4基因在HSC发育和自我更新中的功能，阐明其可能的机制，以期推动对HSC自我更新的全面认识，为下一步进行活体内高通量候选药物筛选提供动物模型，并为人类疾病斑马鱼模型的构建和研究提供参考。

本项目2010年立项，我们按照合同约定的研究内容以及基金委的管理规定开展研究工作，经过3年的努力工作，顺利完成各项研究计划，并按年度提交了进度报告，现将研究工作概要总结如下：. 本研究通过将新发现的一个造血干细胞关键调控分子-Hoxb4 基因导入到模式生物斑马鱼体内，观察在造血细胞分化早期该基因的重要调控作用，为寻找具有开发价值的造血干细胞增殖药物提供理论依据。研究利用Cre-LoxP系统，通过斑马鱼成血成血管共同前体细胞的特异性启动子lmo2驱动Hoxb4，结合EGFP荧光标记技术，建立可示踪的有组织特异性的异位表达Hoxb4的转基因系。通过实时荧光观察、基因组测序、斑马鱼全胚胎原位杂交和western blot的方法，鉴定了组织特异性转基因系;通过WISH和real-time PCR的方法对斑马鱼造血发育中重要的转录因子的mRNA进行检测，从而进行表型分析和筛选。分别收集各组18-48hpf 多个时相点的胚胎，用flash、irx5a、p21、Rap1和cdh5的反义mRNA探针进行全胚胎原位杂交，观察其表达情况。最后，通过流式细胞分选技术分选对照组和实验组36hpf斑马鱼胚胎中含绿色荧光标记的细胞，提取RNA，再进行半定量RT-PCR比较flash、irx5a、p21、Rap1和cdh5基因含量差别。. 本研究在国际上首次成功地建立2个时-空特异性过表达Hoxb4基因的转基因斑马鱼系；在活体上发现Hoxb4在成血成血管共同前体细胞中异位表达后，可增加和延长斑马鱼原始造血过程中HSC的自我更新能力，同时HSC的分化能力未见明显变化。同时，提示在斑马鱼胚胎早期造血发育过程中Rap1和cdh5基因可能作为Hoxb4的下游靶基因共同参与调节造血干细胞的增殖发育。