BNIP3介导的线粒体自噬在锰中毒性帕金森综合症中的作用机制及干预研究

Studies have found that mitophagy are closely related to neurodegeneration diseases such as Parkinson's disease. Meanwhile, manganism can induce to appear the Parkinson-like clinical manifestations. Therefore, mitophagy might be a key link in the progression of manganese-induced neurotoxicity. We have previously demonstrated that mtDNA point mutations are relevant to the pathogenesis of manganese-induced parkinsonism through the Mechanism of mitophagy disorder. We have successfully reproduced the manganese-induced parkinsonism model in rats. Based on above, this study will investigate changes of pro-apoptotic protein BNIP3, autophagy-related proteins LC3, observe the process of mitophagy, and detect the expression of HIF-1, FOXO3, mitochondrial fusion proteins（Mfn1，Mfn2） and the level of ROS in substantia nigra and striatum of the model rats. In this study, the MES 23.5 cells will be selected for the vitro models, small interfering RNA (siRNA) corresponding to BNIP3 will be used to interfere BNIP3. After exposure to continuous MnCl2 for different lengths of times, the levels of LC3, Mfn1, Mfn2, ROS will be determined, the cell viability and the apoptosis in each groups will be evaluated as well. This research Aims to investigate the mechanisms of mitophagy on manganese-induced parkinsonism both at cellular and whole animal levels. The implementation of the project is expected to provide a new perspective and target for the prevention and treatment of manganese-induced parkinsonism.

线粒体自噬与帕金森病等神经变性疾病密切相关，而锰中毒可出现类帕金森病的临床表现，因此线粒体自噬可能是锰致帕金森综合征的一个关键环节。本课题组前期工作发现：线粒体DNA基因突变可能通过线粒体自噬障碍与锰中毒性帕金森综合征发病相关，并已成功制备锰中毒性帕金森综合征大鼠模型。在此基础上，本项目拟研究大鼠中脑黑质、纹状体BNIP3的变化及自噬相关蛋白LC3、观察线粒体自噬的过程，检测各组别HIF-1、FOXO3、线粒体融合蛋白质（Mfn1，Mfn2）的表达情况及ROS的水平。以鼠胚胎中脑神经细胞株MES 23.5细胞为体外模型，使用siRNA特异性干扰BNIP3，给予氯化锰刺激后检测LC3、Mfn1、Mfn2、ROS的水平及各组细胞活力，并观察细胞凋亡情况。旨在从整体和细胞水平探索线粒体自噬在锰中毒性帕金森综合征中的作用机制，课题的实施可望为防治提供一种新思路和药物作用新靶点。

锰广泛存在于地壳中，是人体必需的微量元素，长期慢性的接触锰可引发毒性反应。长期从事冶炼、蓄电池生产及锰矿的开采的工人大多会有类似毒性症状，其突出表现为神经系统损害。广西富含丰富的矿产资源，其中锰矿的开采、加工业正蓬勃发展，在这兴起的行业中，除了职业防护，职业相关的疾病防治显得尤为重要。本研究以多巴胺能神经元SH-SY5Y细胞为实验模型，以氯化锰为刺激物，通过凋亡实验、蛋白免疫印记、免疫共沉淀等证明了BNIP3可作为线粒体自噬蛋白受体通过对ROS的生成调节介导氯化锰诱导SH-SY5Y线粒体自噬的发生。实验结果显示氯化锰可使SH-SY5Y细胞活力呈时间及氯化锰浓度依赖性下降。氯化锰还可使粒体自噬受体蛋白BNIP3的表达量及自噬标记蛋白LC3-I向LC3-II的转化呈浓度依赖性升高；此外，经氯化锰作用24小时后，SH-SY5Y细胞内线粒体膨胀、溶解或聚集、变性并使线粒体自噬小体形成增多，且氯化锰作用下可使线粒体标记物Mito Tracker®及溶酶体标记物LysoTracker®荧光共定位情况增多；自噬抑制剂3-MA可减少氯化锰诱导SH-SY5Y细胞内线粒体自噬小体的形成并减少线粒体标记物Mito Tracker®与溶酶体标记物LysoTracker®荧光共定位情况，其还可减少线粒体自噬受体蛋白BNIP3的表达量及自噬蛋白LC3-I向LC3-II的转化。我们的实验结果还表明SH-SY5Y细胞内ROS生成随氯化锰浓度的加大而增多，使用抗氧化剂NAC可减轻氯化锰诱导ROS的产生，同NAC还可使降低线粒体自噬受体蛋白BNIP3的表达量及自噬蛋白LC3-I向LC3-II的转化及减少线粒体自噬小体形成，而自噬抑制剂3-MA并不能抑制ROS生成。SH-SY5Y细胞中的BNIP3和LC3蛋白可相互结合，干扰BNIP3表达可减少自噬蛋白LC3的生成，同时BNIP3表达减少还可使氯化锰作用后的SH-SY5Y细胞内的线粒体自噬体形成减少。这说明BNIP3的这种功能可能是锰致神经毒性的作用机制之一。此外，本课题组已成功建立锰中毒模型，后期将会继续开展敲除BNIP3在锰中毒模型中的作用机制研究，研究结果将对锰中毒的相关治疗提供依据。