稳定沉默NOR1、NF-κB基因表达对肝癌细胞侵袭和转移的影响及作用机制研究

NOR1是课题组克隆的一个与化学因素致癌相关的基因，前期研究表明NOR1基因与核转录因子NF-κB可能存在相互作用引起细胞粘附分子E-选择素的表达上调从而参与肝癌的发生及转移。本课题拟利用激光共聚焦荧光显微技术和免疫共沉淀分析、报告基因法和点突变技术分析、染色质免疫沉淀等方法明确NOR1基因和NF-κB的相互作用以及与E-选择素启动子结合的作用机制研究；考察利用以miR-30结构为基础的第二代shRNA即shRNAmir高效、稳定沉默NOR1或/和NF-κB基因的表达后对肝癌细胞侵袭和转移能力的影响，并进一步建立肝癌裸鼠移植瘤模型，利用磁共振灌注成像等技术在体内考察NOR1、NF-κB被抑制后对肿瘤组织微血管形成及侵袭能力的改变。本项目通过对环境因素致癌相关基因NOR1的研究将形成研究肿瘤形成遗传因素和环境因素的交叉点，为肝癌的综合治疗和预防提供理论和实验依据。

【NOR1基因在肝癌发生和发展过程中的作用】.我们利用在含HBV信息的肝正常、肝炎、肝硬化、肝癌组织芯片，采用原位杂交，免疫组化试验检测NOR1在mRNA水平和蛋水平的表达差异。结果表明NOR1基因在肝正常、肝炎、肝硬化、肝癌组织中表达逐步增强，进一步证实了NOR1基因在肝癌发生、发展过程中所起的作用。.【NOR1促进CB1954细胞杀伤机制研究】.NOR1 是一个与亚硝胺类化合物致鼻咽癌、肝癌相关的新基因， NOR1基因转染能使肝癌细胞HepG2中生长因子受体结合蛋白2(Grb2) 在mRNA水平的表达增加约4.8倍，Grb2蛋白水平上调大约在8.7倍左右，有显著的变化。结果证实HepG2过转NOR1基因能够加速CB1954对细胞凋亡现象，细胞出现了明显杀伤作用。随后本研究发现NOR1过表达之后CB1954诱导的Caspase-9的表达明显提高，说明NOR1的确促进了CB1954诱导的细胞凋亡的发生。.【NOR1基因在HepG2细胞中呈现高甲基化水平】.目前认为NOR1基因启动子区高甲基化是导致其下调的主要原因，我们通过亚硫酸氢盐修饰直接测序法（BSP）检测了NOR1基因在HepG2细胞中的甲基化水平，发现了甲基化率高达94.4%。在以后的研究中，我们也将检测NOR1基因在不同肝癌分期的患者的甲基化水平，并分析甲基化与化疗药物耐药性、病人预后的相关性，寻找肝癌个体化治疗的分子标记。.【MicroRNA-199a-5p通过靶向作用于NOR1抑制VEGF诱导的肿瘤发生】.用microRNA微阵列技术对HepG2和TMLE-3细胞进行分析，鉴定microRNA的表达异常，结果显示，miR-199A-5P在HepG2细胞下调中起重要作用。我们证实了miR-199A-5P在VEGF过表达的HepG2细胞受到抑制，且呈剂量和时间依赖性。此外，MTT和细胞迁移实验证明miR-199A-5P能够抑制细胞的增殖和迁移。NOR1是miR-199A-5P的下游靶基因，NOR1的上调在miR-199A-5P介导的VEGF诱导HepG2细胞的增殖和迁移的抑制过程中有关键作用。结果表明miR-199A-5P在人类HepG2细胞中，通过NOR1上调和靶向作用在调节细胞增殖和迁移过程中起关键作用。