shRNAmir稳定沉默Grb2表达对NOR1基因增强CB1954细胞毒性的影响及相关信号通路研究

NOR1是申请者克隆的一个与化学因素致癌相关的基因。前期研究表明NOR1基因在鼻咽癌细胞系CNE1、 肝癌细胞系HepG2中过表达均能提高2-硝基苯氮丙啶类化合物CB1954的细胞毒性作用，并能使生长因子受体蛋白Grb2的表达增加。本课题拟考察利用以miR-30结构为基础的第二代shRNA即shRNAmir高效、稳定沉默Grb2表达后对上述细胞系中NOR1基因增强CB1954细胞毒性的影响，检测其可能涉及的主要细胞增殖信号通路Ras/MAPK,PI3K/Akt相关分子的活性及表达变化；并进一步建立NOR1/CB1954系统癌细胞移植瘤动物模型考察抑制Grb2表达后对癌细胞在裸鼠中成瘤作用的影响，并在移植瘤组织中检测关键分子的活性及表达情况。本课题通过在分子、细胞、组织、整体水平深入探讨NOR1基因增强CB1954诱导的细胞毒性的分子机制，为环境因素致癌防治研究提供理论和实验依据。

硝基还原酶基因NOR1(oxidored-nitro domain containing protein 1)是一个重要的抑瘤基因，它在鼻咽癌、肝癌等肿瘤发生发展中起着重要的抑瘤作用。前期研究结果表明NOR1基因具有与细菌硝基还原酶NTR相似的功能,能够将单功能烷基化试剂2-硝基苯氮丙啶类化合物CB1954的第4位硝基还原成亚硝基从而生成细胞毒性物质起到杀死肿瘤细胞的作用，但其具体作用机制不明。在利用cDNA微阵列和荧光定量PCR实验我们发现NOR1过表达能使肝癌细胞系HepG2中生长因子受体结合蛋白2 （Grb2）在mRNA水平上表达增高4.8倍。在本研究中我们发现NOR1过表达能使Grb2蛋白水平在HepG2细胞系中上升3倍，通过细胞毒性实验，发现NOR1能增强CB1954在肝癌细胞系HepG2的细胞杀死率，加入酪氨酸激酶抑制剂genistein以及转染Grb2寡核苷酸抑制剂都能抑制CB1954引起的细胞毒性。Western-blot 试验表明转染Grb2抑制剂能抑制其蛋白表达，并能抑制Grb2下游分子MAPK的活性。结果提示NOR1可能通过上调Grb2表达参与MAPK信号通路增强CB1954的细胞毒性，使肝癌细胞系HepG2的细胞死亡率增加。HepG2过转NOR1基因在CB1954诱导下能够使Caspase-9的表达明显提高，结果提示NOR1促进了CB1954介导的细胞凋亡的发生。. 我们的研究也发现在肝癌、鼻咽癌组织中也存在NOR1基因的高度甲基化：. 通过亚硫酸氢盐修饰直接测序法（BSP）检测了NOR1基因在HepG2细胞中的甲基化水平，发现甲基化率高达94.4%。. 鼻咽癌（NPC）组织标本和细胞系中存在NOR1启动子CpG岛的高甲基化。NOR1基因启动子受热休克蛋白1 和核呼吸因子1调节，NOR1启动子高甲基化是引起NOR1基因沉默的重要机制，NOR1基因是一个重要的鼻咽癌抑瘤基因。. 我们课题组研究还发现NOR1基因参与鼻咽癌细胞细胞自噬、调亡，NOR1基因的过表达减少了鼻咽癌细胞的细胞自噬基础水平，在加入肿瘤化疗药物顺铂后效果更明显；NOR1过表达能增加顺铂诱导的细胞毒性，增加细胞凋亡；这为开展NOR1基因联合化疗药物顺铂对肿瘤的治疗提供了新的思路。