TXNIP对牛卵母细胞体外成熟中葡萄糖代谢调控机制的研究

Research shows that thioredoxin-interacting protein (TXNIP), which regulates intracellular glucose metabolism, is a critical regulator of glucose metabolism in mouse oocytes, but the exact mechanism of action on bovine oocytes is still unclear. This project takes bovine oocyte matured in vitro as the research object, firstly, TXNIP expression level is analyzed among different stages (GV, GVBD, MI, MII) of bovine in vitro matured oocytes. Followed by adding an exogenous inhibitor of TXNIP, the glucose uptake into oocytes is examined. Using RNA interference (RNAi) method, the effect of TXNIP on bovine oocytes maturation in vitro, the spindle and chromosomal organization during oocyte maturation, glucose uptake into oocytes, as well as the influence on glucose metabolic enzymes (PFK, G6PDH, LDH) and transcriptional factors (FOXO1, MLX, NF-Y) are examined to reveal the regulation mechanism of TXNIP. The findings will not only provide reference for abnormal metabolism studies of mammalian germ cell, but also improve the in vitro oocyte maturation technique, therefore, the project has important application prospect.

研究发现，硫氧还蛋白相互作用蛋白（thioredoxin-interacting protein, TXNIP）参与胞内葡萄糖代谢，并已证实对小鼠卵母细胞的葡萄糖代谢具有重要的调控作用，但其对牛卵母细胞的具体作用机制还不清楚。本项目以牛体外成熟卵母细胞为研究对象，检测TXNIP在牛卵母细胞体外成熟GV、GVBD、MI、MII各时期的表达；通过抑制剂抑制TXNIP来观察卵母细胞摄取葡萄糖能力的变化；进一步通过特异性干扰TXNIP，研究TXNIP对卵母细胞体外成熟率、减数分裂纺锤体和染色体、摄取葡萄糖的能力、葡萄糖代谢酶PFK、G6PDH、LDH以及转录因子FOXO1、MLX和NF-Y表达的影响，以揭示其调控机制。研究项目不仅可为哺乳动物生殖细胞代谢异常的研究提供重要的参考，而且有利于进一步完善家畜卵母细胞的体外成熟技术，因此具有重要的应用前景。

葡萄糖是卵母细胞成熟发育的重要能源物质，能够调节卵母细胞的减数分裂进程，影响其发育潜能。硫氧还蛋白相互作用蛋白（thioredoxin-interacting protein, TXNIP）属于硫氧还蛋白超家族成员，是α-抑制蛋白家族的成员，能负性调节细胞的葡萄糖摄取能力。本研究以牛卵母细胞为研究对象，通过抑制剂和小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）下调TXNIP表达，观察卵母细胞体外成熟率、摄取葡萄糖的能力及对糖酵解和磷酸戊糖途径的影响，以揭示其调控机制。通过检测TXNIP蛋白在卵母细胞体外成熟不同时期的表达情况发现，TXNIP蛋白在MII期卵母细胞中的表达量显著低于GV期、GVBD期和MI期卵母细胞中的表达。TXNIP siRNA和azaserine下调TXNIP表达后，卵母细胞摄取葡萄糖的能力均显著增强。TXNIP siRNA注射组卵母细胞的成熟率（94.7%±1.08%）显著高于对照组（85.30%±2.69%）和阴性对照注射组（NC siRNA）（86.48%±1.89%）；孤雌胚胎的囊胚发育率和囊胚细胞总数（43.20%±3.26%和95.75±10.63）也显著高于对照组（33.10%±2.56%和78.0±7.27）和NC siRNA处理组（33.48%±2.80%和79.0±7.72）。敲降TXNIP后，牛卵母细胞中磷酸果糖激酶（PFK）、丙酮酸激酶（PK）和乳酸脱氢酶（LDH）活性显著增加、丙酮酸和乳酸生成增多、胞内ATP水平以及线粒体活性显著增强，表明下调TXNIP显著提高了牛卵母细胞的糖酵解活性。同时，TXNIP RNAi处理促进了葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）活性，胞内NADPH生成增多，维持了卵母细胞内高水平的谷胱甘肽（GSH）和低水平的ROS环境，表明下调TXNIP也显著增强了卵母细胞的磷酸戊糖途径活性。进一步的研究发现，RNAi抑制TXNIP显著提高了卵母细胞中GLUT1的mRNA水平和蛋白表达水平。本研究结果表明，TXNIP RNAi通过增强糖酵解活性和磷酸戊糖途径代谢活性促进卵母细胞成熟。TXNIP作为调节葡萄糖摄取的关键调节因子，通过调控GLUT1表达影响牛卵母细胞体外成熟。