miRNA-192 / PPARγ对猪体外成熟卵母细胞脂滴代谢的调控机制

Studies have confirmed that the content of lipid droplets is an important factor of restricting the quality of oocytes. Our previous experiments also show that reducing the content of lipid droplets in porcine oocytes are beneficial to improve in vitro maturation (IVM) rate of the oocyte and embryo quality of in vitro fertilization (IVF). However, molecular mechanism of related oocyte lipid droplet metabolism is still unclear. Through the miRNA chip technology, we found that the miRNA-192 and PPARγ pathway may be involved in regulation mechanism of lipid droplet metabolism in porcine oocytes. To verify the scientific hypothesis, this project is conducted to test the miRNA-192 and its target genes expression, PPARγ and its regulation of the downstream JNK pathway change, through over/low expression of the miRNA-192 and the activation/inhibition of PPARγ pathway and other technological means in order to further investigate lipid droplet metabolic regulation function by the miRNA-192 and PPARγ pathway in porcine IVM oocytes, clarify regulation network relationship in the lipid droplet metabolism and maturation in porcine oocytes. And after the berberine (Ber) is added to the IVM medium, this project is to further explore its molecular pathways for reducing content of oocyte lipid droplets and improving the quality of oocyte maturation and blastocyst development, in order to optimize IVM system of porcine oocytes and provide theoretical and data support.

有研究已证实脂滴含量是制约卵母细胞质量的重要因素。我们前期实验也表明减少猪卵母细胞中脂滴含量，有益于提高卵母细胞体外成熟（IVM）率及体外受精（IVF）胚胎的发育质量。然而，卵母细胞脂滴代谢的相关分子机制尚不十分清楚。我们通过miRNA芯片技术发现，miRNA-192及PPARγ通路可能参与猪卵母细胞脂滴代谢的分子机制调控。为验证这一科学假设，本项目通过过/低表达miRNA-192和激活/抑制PPARγ通路等手段，检测miRNA-192及其靶基因表达、PPARγ及其调控的下游JNK通路变化，深入研究miRNA-192和PPARγ通路对猪IVM卵母细胞脂滴代谢的调控作用，阐明其对猪卵母细胞脂滴代谢及卵母细胞成熟的调控网络关系。并通过向猪卵母细胞IVM液中添加小檗碱（Ber），探索其降低卵母细胞脂滴含量，提高卵母细胞成熟及其囊胚发育质量的分子途径，为优化猪卵母细胞IVM体系提供理论及数据支持。

有研究证实脂滴含量是制约卵母细胞质量的重要因素。然而，卵母细胞脂滴代谢的相关分子机制尚不十分清楚。本项目首先通过在猪卵母细胞体外成熟液中添加小檗碱（berberine，Ber），向猪卵母细胞质中显微注射miRNA-192过/低表达剂，双荧光素酶报告基因和RNAi分别检测和验证miRNA-192的靶基因，研究Ber和miRNA-192对猪IVM卵母细胞脂滴代谢的调控作用及其机制。其次在其体外成熟液中添加PPARγ激动剂/抑制剂，以及PPARγ激动剂+JNK抑制剂和Ber，研究 Ber和 PPARγ及其下游通路JNK对猪卵母细胞体外成熟脂滴代谢及卵母细胞质量的调控作用；最后探讨 miR-192与PPARγ通路之间的关系，阐明Ber促进猪卵母细胞体外成熟过程中脂滴代谢，提高卵母细胞质量的作用机制。我们发现Ber可提高猪卵母细胞体外成熟和体外受精囊胚发育率，并降低卵母细胞中脂滴含量，提高成熟卵母细胞中miRNA-192的表达，减少SREBP和PPAR γ的表达（P < 0.01）；miRNA-192的靶基因为SREBP1和PPARγ。 PPARγ的表达变化影响猪卵母细胞体外成熟率及脂滴含量；激活PPARγ可以抑制PPARγ磷酸化，促进JNK磷酸化的表达，Ber对PPARγ磷酸化有极显著促进作用，抑制JNK磷酸化（P < 0.01）；Ber和PPARγ抑制剂均可以促进猪卵母细胞中miRNA-192的转录水平；PPARγ激动剂对FABP3、SREBP1和PPARγ表达有显著的促进作用，而Ber与PPARγ激动剂作用相反（P < 0.01）；JNK抑制剂则起到了降低PPARγ激动剂的作用。miR-192过表达可以提高PPARγ磷酸化，抑制JNK磷酸化，Ber可以通过上调miR-192，抑制JNK磷酸化的表达，增强PPARγ磷酸化表达。本研究表明，激活PPARγ可以下调miR-192的表达水平，上调FABP3、SREBP1和PPARγ的表达水平，降低PPARγ磷酸化水平，提高JNK磷酸化水平，增加脂质含量；抑制PPARγ下游JNK进而降低PPARγ的作用； Ber可以上调miR-192，降低脂质合成相关基因的表达，促进PPARγ磷酸化，抑制JNK磷酸化，促进脂质代谢。可见Ber和PPARγ均可以通过miR-192表达调控猪卵母细胞体外成熟过程中脂滴代谢，而有利于猪卵母细胞体外成熟。