Pif1解旋酶抑制剂的发现及其作用机制研究

Pif1 helicase is one of superfamily 1B(SF1B) members, which can utilize the energy of ATP hydrolysis to unwind the double-stranded DNA, DNA/RNA hybrid, G4 DNA (G-quadruplex DNA) in the direction of 5’ to 3’. Moreover, Pif1 is highly related to tumors and is a potential anti-tumor target. While, there are no Pif1 inhibitors been reported before. This study is dedicated to finding novel small-molecule inhibitors targeting Pif1 in national compounds library by using TSA (Thermal Shift Assay) high-throughput screening and demonstrating the molecular mechanism of their function via helicase activity experiment, co-crystallization technology and so on. This study will not only help us to understand the function mechanism of Pif1 in depth, but also provide the basis and guidance for the development of helicase-based anti-tumor drugs.

Pif1是解旋酶SF1B超家族成员，能够利用ATP水解提供的能量，对双链DNA，DNA/RNA杂合体，G4 DNA(G-quadruplex DNA)进行5’→3’方向的解旋，是一类与肿瘤密切相关的解旋酶及潜在的抗肿瘤靶点。然而针对Pif1家族蛋白，目前并没有报导过相关小分子抑制剂。我们已经解析了细菌BaPif1单体结构，及其结合单链DNA、双链DNA的复合物晶体结构。在此基础上，本项目意在通过TSA（Thermal Shift Assay）高通量筛选技术从天然化合物库中发现Pif1的小分子抑制剂，再结合体外解旋酶活性实验，共结晶技术等来阐明其作用的分子机制。这项研究不仅能够帮助我们更深入的理解Pif1解旋酶的作用机理，而且能够为基于解旋酶的抗肿瘤药物研发提供基础和指导。

Pif1解旋酶在维持基因组稳定性中起着重要作用。用小分子对Pif1的活性进行调节是解旋酶相关疾病治疗和研究的重要干预手段。在这里，通过荧光偏振高通量筛选，我们发现了一种FDA批准的小分子，Tideglusib（TD），可抑制类杆菌Pif1（BaPif1）的DNA结合活性，IC50值为6.2±0.4µM。生化分析表明，TD还可抑制BaPif1的ATP酶和解旋酶活性，IC50值为2~4µM。TD对人源Pif1（hPif1）的DNA结合、ATP酶和解旋酶活性具有类似的抑制作用。此外，TD类似物TDZD-8对Pif1的活性表现出类似的抑制作用，IC50值略有增加。此外，过滤实验显示TD不可逆地抑制BaPif1。尺寸排除色谱数据表明，TD显著诱导BaPif1聚集，这解释了不可逆性抑制的分子机制。另外在DTT存在下，TD抑制BaPif1的能力显著降低，表明TD是一种硫醇反应性化合物。因此，我们把BaPif1的380位半胱氨酸突变成丙氨酸，该突变导致TD活性降低；具体而言，DTT的IC50逆转了50µM TD对BaPif1的DNA结合活性的抑制作用，野生型为~39.9µM，而突变型则>1 mM。最后，我们还检测了TD对肿瘤细胞的生长抑制作用，TD能够显著抑制Hela细胞和U2OS细胞的生长，IC50值为5~10µM。本研究发现 TD通过不可逆的抑制Pif1的活性，其作用机制需要Cys-380的参与。