BLM解旋酶小分子抑制剂的发现及其分子机理研究

BLM helicase plays a significant role in maintaining the stability of genome. The genetic mutations in this enzyme will lead to Bloom’s syndrome and accompany with predisposition to various cancers. However, its molecular mechanism is unclear. It will provide valuable information for a deeper and comprehensive understanding on its molecular mechanism to discover small molecular inhibitors of BLM helicase. There are rare reports on it. The applicant puts forward this research project based on fruitful study results on biological activities of BLM helicase as followings: (1) Small molecular compounds with high affinity to BLM helicase can be obtained based on both virtual screening method and protein thermal shift assay. Subsequently, new small molecular inhibitors can be discovered through activity screening based on stopped-flow spectroscopy assay. (2) The molecular mechanism can be elucidate by a comprehensive analysis from multi-angles concerning complex crystal structure of BLM helicase and its inhibitors, thermodynamic parameters from isothermal titration calorimetry and interactive function analysis from molecular docking. The research results are valuable to understand significant role of BLM helicase in maintaining chromosomal stability and to analyze molecular nosogenesis of Bloom disease. Furthermore, this research would also provide experimental and scientific basis for treatment of Bloom disease and development of anti-cancer leading compounds and sensitizers related to proliferation of BLM helicase.

Bloom(BLM)解旋酶在维护基因组稳定性方面发挥巨大作用，其突变会导致Bloom综合症的发生，并伴随严重的癌症倾向，其分子机理尚不清楚。BLM解旋酶小分子抑制剂的发现能为深入理解其分子机理提供重要信息，但其抑制剂却鲜有报道。申请人在前期对BLM解旋酶生物学活性进行大量研究的基础上，拟基于已有化合物库，采用虚拟筛选与蛋白质热转移技术初筛获得与BLM解旋酶亲和力较高的小分子化合物，并采用基于停流技术的抑制活性筛选发现其新型小分子抑制剂。拟采用多角度综合分析技术，分析小分子抑制剂与BLM解旋酶复合物晶体，结合等温滴定量热法测定的热力学参数与分子模拟相互作用参数，揭示BLM解旋酶的分子机制。该研究有助于深刻理解BLM解旋酶在维持染色体稳定性中的重要作用，探讨Bloom综合症的分子致病机理，并为Bloom综合症的治疗及依赖于BLM增殖的抗肿瘤先导药物或化疗药增敏剂的研发提供实验基础与科学依据。

BLM解旋酶在维护基因组稳定性中发挥关键作用，其突变会导致Bloom综合症并伴随癌症发生，但其分子机理尚不清楚，小分子抑制剂发现对深入探究其作用机制十分重要。本项目旨在通过虚拟筛选与靶标-配体分子互作筛选，发现新型BLM解旋酶抑制剂，并采用基于荧光共振能量转移与停流技术，评价其酶抑制活性，采用人源肿瘤细胞评价其体外抗肿瘤活性。研究表明，采用基于药效团模型的虚拟筛选获得目标化合物24个，进一步采用基于蛋白质热漂移实验的分子互作筛选，与BLM结合力较强的目标化合物6个（ΔTm>3°C），最优者8号与22号化合物。8号化合物可通过氢键和疏水作用与BLM的DNA结合域口袋结合，可显著抑制BLM的ATP水解活性和DNA解旋比例与速率，可选择性抑制BLM，对BLM解旋叉状DNA的抑制作用最强。但是，对BLM与DNA的结合活性与蛋白聚集状态无影响。22号化合物可通过氢键和疏水作用与BLM的DNA结合域口袋结合，可减弱BLM的ATP水解活性和解旋活性，显著抑制BLM叉状DNA解旋能力。但是，其抑制专一性不强，对BLM的双链DNA结合能力与蛋白聚集状态无影响。推测2个化合物通过干扰BLM的ATP水解活性发挥抑制作用，这与现有BLM抑制剂的作用机理完全不同。研究表明，8号化合物对人胃癌细胞增殖有较强抑制活性，可诱导人胃癌细胞株BGC823细胞周期阻滞于G1期，促进其细胞坏死细胞，但对细胞迁移无明显抑制作用。综上，本项目发现新型BLM抑制剂2个，可通过损伤BLM的ATP水解活性，抑制其解旋活性，但其并非作用于ATP结合口袋，可能与别构调节机制有关。本项目研究成果有助于深入理解BLM的分子作用机理，为依赖于BLM增殖的抗肿瘤先导药物或化疗药增敏剂的研发提供科学依据。