Pif1解旋酶对双链DNA，DNA/RNA杂合体及G4 DNA解旋的分子机制研究

Pif1 is a superfamily 1B (SF1B) DNA helicase involved in regulating many biological processes in cells through unwinding double stranded DNA (dsDNA), DNA/RNA hybrid and G4 DNA by using the energy of ATP hydrolysis. Through unwinding of the template RNA of telomerase from the telomere DNA, Pif1 displaces telomerase from telomere to maintain the stability of the telomere. In the process of replication and translation, Pif1 resolves the G4 structure rapidly to maintain the stability of genome. Pif1 also participates in okazaki fragment maturation and promotes break-induced replication (BIR). In this study, we will primarily use X-ray crystallography in conjunction with biophysical, biochemical, molecular and cell biology approaches to study the molecular basis of Pif1 unwinding dsDNA, DNA/RNA hybrid and G4 DNA. The results gained from this study not only would elucidate the molecular mechanism of Pif1 helicases, but also could provide insights into the role of Pif1 in maintaining genome stability. Our research may also provide new strategy for design of anticancer drugs.

Pif1是解旋酶SF1B超家族的成员，Pif1能够利用ATP水解提供的能量，对双链DNA，DNA/RNA杂合体，G4 DNA进行解旋。由于其底物的多样性，Pif1参与了细胞中多种生物学过程的调控。Pif1可以通过解链端粒酶模板RNA与端粒DNA，使端粒酶从端粒游离下来，从而调控端粒的稳定性。在复制及转录过程中，Pif1能够迅速解开G4结构，维持基因组的稳定性。Pif1还参与了冈崎片段的成熟及DNA损失修复的BIR途径。本项目主要利用X光晶体衍射技术，结合生物化学、生物物理及分子与细胞生物学的方法，研究Pif1与双链DNA，Pif1与DNA/RNA杂合体，Pif1与G4 DNA的复合物晶体结构，从而阐明Pif1解旋不同底物的分子机制。这项研究不仅能够详细阐释Pif1解旋酶分子机制，而且能进一步揭示其维持基因组稳定性的重要作用，还可为抗肿瘤新药研究提供新的靶点和思路。

Pif1家族是一组在所有真核生物以及某些原核生物和病毒中均已鉴定出的DNA解旋酶，沿5’-3’方向解旋DNA, 属于超家族1（SF1B）解旋酶。Pif1利用水解ATP产生的能量，解旋dsDNA或破坏稳定的核蛋白复合物来维持细胞核和线粒体基因组的稳定性，包括冈崎片段加工、端粒稳态和解旋G-四链体（G-quadruplex,G4）结构。Pif1在维持基因组稳定性方面起着多种作用，并且优先解开分叉状dsDNA，然而Pif1解旋分叉状dsDNA的分子机制尚不清楚。本研究，我们成功解析了拟杆菌Bacteroides sp Pif1（BaPif1）与对称双分叉dsDNA复合物的结构。我们发现两个相互作用的BaPif1分子分别结合到dsDNA的每个分叉结构的单链部分，并分别与5’ arm和3’ ss / dsDNA junction区域相互作用。两个BaPif1分子中均具有解旋酶活性，且它们之间的相互作用可能调节其解旋酶活性。结合到5’arm的BaPif1分子打开第一个碱基对，从而启动BaPif1对分叉状 dsDNA的解旋过程，而结合到3’arm的BaPif1分子则通过稳定第一个断裂的碱基对，在解旋过程中起辅助作用，使第二个碱基对处于断裂前状态。随后的动力学（Kinetics）和单分子荧光共振能量转移（smFRET）分析进一步支持了这一结论。我们的结果不仅合理地解释了先前的生化实验结果，而且对两个BaPif1如何相互协调以解开分叉的dsDNA提供了前所未有的洞见。