基于荧光标记人工抗体技术的发酵食品中生物胺高通量快速检测技术研究

发酵食品中存在生物胺，过量生物胺摄入对人体产生严重的危害，日益受到关注。发酵食品基分复杂，生物胺的分离富集检测是保证发酵食品安全的重要举措之一。本研究融合新功能材料量子点和分子印迹聚合物的优势，实现发酵食品中生物胺高通量快速检测。以生物胺中的酪胺和组胺为印迹分子，利用光谱学技术和计算机模拟技术筛选和合成针对印迹分子的最佳功能单体，优化最佳聚合体系，提高所制备印迹聚合物的选择性和亲合性，降低非特异性吸附。利用沉淀聚合方法制备用于生物胺高效分离富集的印迹聚合物微球，用作固相萃取分离富集；以量子点为核心，对其表面衍生化，制备核壳型荧光标记分子印迹聚合物微球,即荧光标记人工抗体。利用印迹分子与所制备的荧光标记人工抗体再结合时发生荧光淬灭作用，将荧光标记人工抗体与酶标仪联用建立用于发酵食品中生物胺分离富集检测于一体的高通量快速检测方法，检出限达到10μg/kg，同时阐明生物胺印迹聚合物微球识别机理。

生物胺广泛存在于发酵食品中，高浓度可引发偏头疼，目前方法检测存在困难。近十几年来分子印迹技术、计算机模拟技术和量子点技术被广泛应用于各个领域。本研究融合多种技术解决生物胺的快速检测技术难题。计算机模拟筛选功能单体，采用Gaussian软件中Hartree-Fock方法，6-31G(d)基组计算酪胺和甲基丙烯酸（MAA）、丙烯酸（AA）、甲基丙烯酸甲酯（MMA）和对乙烯基苯甲酸（P-VBA）4种功能单体的能量。用结合能(△E)来反映酪胺与不同功能单体之间的相互作用，比较模板分子与功能单体相互作用的强弱，选择最佳功能单体，计算机模拟结果表明MAA和P-VBA与模板分子的结合能(△E)最小，作用力较强，且最佳反应比为1:3；通过紫外光谱法研究了酪胺与MAA相互结合的机理，结果表明1个酪胺分子与1个MAA分子发生作用。说明溶剂对其分子间识别存在应影响。以酪胺为模版分子在 MAA、AIBN、EGDMA的存在下在乙腈中制备了酪胺分子印迹聚合物微球。室温下它们的吸附等温线经过Langmuir数学模型分析得到酪胺印迹聚合物的最大表观吸附量Bmax =325.0 μmol/g和解吸常数KD=0.577 mmol/L。聚合物选择性较好，通过静态平衡吸附实验研究了聚合物微球对模板分子的识别和吸附能力，大约8 h左右酪胺聚合物基本可以达到吸附饱和状态。此方法合成的印迹聚合物微球对酪胺有较好的结合性能，可应用于酪胺的分离检测。.通过紫外光谱法对组胺与MAA的结合机理进行了分析，结果表明在研究的浓度范围内，组胺与MAA在溶剂中形成了稳定的 1：2 主客体配合物。而计算机模拟结果表明对乙烯基苯甲酸与组胺为3：1为最佳。实验中以组胺为模版分子，利用沉淀聚合法，在 MAA、AIBN、EGDMA的存在下在乙腈-乙二醇(20：1 v/v)中一步制备了组胺分子印迹聚合物微球。通过静态平衡吸附实验和Scatchard模型研究了聚合物微球对模板分子的吸附特性。印迹聚合物在6 h 后逐渐达到吸附平衡，Langmuir数学模型分析组胺聚合物最大表观吸附量为170.5 μmol/g和解吸常数0.18 mmol/L。.本体聚合制备生物胺印迹聚合物，粉碎至合适粒径，制备固相萃取柱实现生物胺的分离富集，优化分离富集条件。.以油酸为稳定剂，采用“一锅法”合成了高质量的CdSe/ZnS 核壳量子点，紫外-可见吸收光谱吸