基于上转换荧光标记技术的MicroRNA高通量检测及细胞成像分析

MicroRNA(miRNA)的高灵敏度、高通量检测及活细胞中表达分析对于其生物功能研究至关重要。本项目创新性地将上转换荧光标记技术用于多组分miRNA高灵敏度同时检测及活细胞中成像分析。一方面，创新性结合核酸反转录及连接技术，一次性构建所有miRNA环形模板文库，使所有miRNA同时滚环扩增，分别形成具有大量重复序列的微米DNA团簇，采用上转换荧光颜色编码及光谱编码技术对DNA簇进行特异性标记识别，可通过共聚焦荧光成像或流式细胞仪获取单个DNA簇的荧光信息，实现miRNA高通量、单分子检测。另一方面，创新性提出将上转换荧光纳米材料/氧化石墨烯复合体系用于活细胞中miRNA成像分析。上转换荧光材料发光强且抗光漂白，近红外激发光在细胞中穿透能力强，可避免生物样品自发荧光背景，显著提高成像分析的信噪比及灵敏度，同时石墨烯可保护核酸探针免于酶解，为活体细胞中miRNA表达分析提供了理想技术平台。

在本项目的资助下，对新型疾病标志物microRNA (miRNA)的高灵敏度及高通量分析进行了系统研究。一方面，创新性采用杂交链式反应(HCR)、茎环探针催化自组装(CHA)等技术在无酶催化条件下实现了miRNA等核酸分子的高效扩增和高灵敏度检测，结合氧化石墨烯等新材料及流式细胞仪、荧光成像等新的检测技术，在特定miRNA靶分子的高灵敏度分析方面建立了一系列新的检测方法，这类无酶扩增手段摆脱了常规核酸扩增技术对各种酶制剂的依赖，非常适用于复杂样品体系的核酸分析，为活体miRNA成像检测奠定了良好基础。另一方面，基于miRNA的疾病诊断往往需要对多种miRNA（一般为2～15种）含量进行同时分析，而满足该要求的微阵列技术及核酸测序技术仪器和试剂都价格高昂，一般检测机构很难进行。针对这一问题，在本项目资助下，我们在多重miRNA同时检测方面也进行了系统研究。我们创新性地将核酸连接PCR与链长编码技术相结合，针对不同miRNA设计不同长度的编码核酸探针，不同的miRNA靶标的连接产物就具有不同的长度，只需采用一对通用引物即可在一个反应中同时对这些编码miRNA的多种连接产物进行PCR扩增，采用毛细管电泳对不同长度的产物进行分离并结合激光诱导荧光进行信号检测，即可实现多种miRNA的高灵敏度同时检测。这方面的研究技术在保证了高灵敏度的同时，大大降低了多重miRNA分析的成本，在以多种miRNA为标志物的特定疾病筛查方面展现出了良好应用前景。.此外，研究表明，多种人类疾病均和蛋白激酶的活性异常密切相关，因此蛋白激酶活性分析对于疾病诊断和靶向药物开发都具有重要意义，在本项目资助下，我们也在蛋白激酶活性分析方面进行了积极探索。为克服传统激酶分析方法对放射性标记及价格昂贵的磷酸化识别抗体的依赖，我们在基于新型功能材料的蛋白激酶活性分析方面进行了创新性的初步探索，开发出一系列操作简单、成本低廉、灵敏度高的蛋白激酶活性检测新方法。.本项目建立的简单、实用、高灵敏度的miRNA及蛋白激酶活性分析方法有望为以miRNA或激酶为靶标的疾病早期诊断以及靶向药物开发提供强有力的技术平台。