基于重组抗体的水环境中痕量重金属高通量检测技术研究

近年来，随着现代工农业的发展，我国水体重金属污染日趋严重。水环境中的重金属不仅直接污染饮用水源及娱乐用水，并造成土壤的二次污染，还会富集于鱼类等水生动物体内，通过食物链危害人类健康。开展水环境重金属检测技术研究是水体重金属污染的重要研究内容之一。目前的检测方法不能适应高通量快速筛检的需求。本研究拟利用双功能螯合剂分别螯合重金属和载体蛋白，合成能被动物免疫系统识别的完全抗原- - 重金属-螯合剂-载体蛋白。采用细胞融合技术，筛选分泌抗重金属的单克隆抗体杂交瘤细胞株。应用重叠延伸PCR技术对单克隆抗体的可变区基因(VH和VL)进行重组，构建重组抗体的表达载体，表达并纯化重组抗体。以重组抗体为探针，探讨重金属的高通量免疫筛检方法。本项目的实施将为水环境中重金属检测的新方法和新技术提供理论依据和实验基础，为水体重金属污染的控制与治理提供技术支撑。

1. 合成了可特异性识别Hg(II)的纳米金探针，基于此探针设计了检测Hg(II)的高通量酶联分析方法和免疫层析分析方法。当离子浓度达到5000ppb时，该探针与Ca(II), Co(II), Al(III), Cr(I), Fe(II), Cd(II), Fe(III), Mg(II), Mn(II), Pb(II)和Cr(VI)没有交叉反应。酶联分析方法可同时检测多个样品，最低检测线为0.1ppb (Analytica Chimica Acta, 2012, 724: 98-103. [IF =4.555])。免疫层析分析方法仅需15min，肉眼检测线为1ppb (Biosensors and Bioelectronics, 2010, 25 (11): 2534-2538. [IF=5.361])。.2. 制备了基于HRP信号放大的可特异性识别Cr(III)的高灵敏探针。并基于合成的探针设计了Cr(III)的检测方法。最低检测限为0.04 μM，比已报道的未经HRP作为信号放大探针的敏感性提高45倍 (Sensors & Actuators: B. Chemical, 2012, 161 (1): 1108-1113. [IF =3.898])。.3. 合成了基于AuNPs的集“广谱性”和“高敏感性”于一体的酶联信号放大探针。并将此探针成功应用于重金属离子Hg(II)、Cd(II)和Pb(II)的检测，设计了同时检测和分别检测2种模式 (Biosensors and Bioelectronics, 2011, 30 (1): 310-314. [IF=5.602])。该方法的最低检测线可达9 pg/mL，检测敏感性比传统ELISA高出20倍 (Biosensors and Bioelectronics, 2011, 26 (8): 3700-3704. [IF=5.602])。此项成果对其它半抗原的检测具有重要的借鉴意义。.4. 建立了基于单克隆抗体的Cu(II), Hg(II), Cd(II)和Pb(II)的免疫层析试纸条检测方法。检测过程在10分钟之内即可完成。对Cu(II)的最低检测线为20ng/mL. 对Hg(II), Cd(II)和Pb(II) 的最低检测线为分别为8, 6 and 6 nM (论文在撰写中)。