香烟凝集物通过RNA-m6a甲基化修饰调控miRNA-25成熟在胰腺癌致病机制中的作用

We found that cigarette smoking condensates (CSC) could significantly increase the expression of miRNA-25 with the tumor promoting function by using miRNA microarray, and preliminary results suggest that CSC can upregulate the expression of METTL3, which is a catalytic enzyme of RNA-m6a methylation, it has the function of promoting miRNA-25 maturation by catalyzing m6A methylation on pri-miRNA-25. However, the molecular mechanisms involved in this regulation have not been fully elucidated. Based upon these results, the applicant is planning to carry out a series of experiments on molecular, cellular and animal levels, which will obtain the key evidence that CSC induced upregulation of miRNA-25 involved the pathogenesis of pancreatic cancer, evaluate the role of METTL3 mediated RNA-m6a methylation in promoting the maturation of miRNA-25, and further reveal the miRNA-25 downstream target gene and signaling pathway. The findings of this project will be of significance for prevention and target therapy of pancreatic cancer.

我们通过miRNA表达谱芯片检测发现，香烟凝集物(cigarette smoking condensates，CSC)能够引起具有促癌功能的miRNA-25表达显著升高，初步的研究结果提示CSC可以上调RNA-m6a甲基化酶METTL3的表达，其具有催化pri-miRNA-25上m6a甲基化形成进而促进miRNA-25成熟的功能。然而，这其中所涉及的分子调控机制尚未被完全阐明。本项目拟通过一系列分子、细胞和动物水平实验进行深入探讨，旨在获得CSC引起miRNA-25表达升高导致胰腺癌发病的关键性证据，评价及证实METTL3介导的RNA-m6a甲基化促进miRNA-25成熟剪切在胰腺癌致病机制中的作用，并进一步揭示miRNA-25下游靶基因及信号调控通路。此项目是基于我们前期结果而进行的深入研究，既具重要性又具原创性，研究结果对胰腺癌的防治及寻找药物靶点都将具有重要意义。

胰腺癌的确切病因及发病机制尚不明确，流行病学研究显示吸烟是胰腺癌的重要病因因素。吸烟是如何引起胰腺癌发生发展以及在这个过程中涉及的分子作用机制，尚未完全阐明。我们用香烟凝集物在体外处理胰腺导管上皮细胞，然后分析其microRNA表达情况，并通过一系列生物化学和分子生物学实验，揭示香烟在胰腺癌发生发展中的作用机制。我们用microRNA芯片检测香烟凝集物处理和未处理的胰腺导管上皮细胞中microRNA表达的差异，发现miR-25-3p是香烟凝集物诱导表达上调最显著的microRNA。定量PCR检测结果提示，miR-25-3p在胰腺癌细胞及临床胰腺癌标本中的表达量显著高于正常胰腺细胞及正常胰腺组织。miR-25-3p表达高的胰腺癌细胞在体内外增殖和迁移侵袭能力都比miR-25-3p表达低的胰腺癌细胞显著增强。胰腺癌组织中miR-25-3p表达高比表达低的患者预后更差。我们发现吸烟者血清中miR-25-3p含量显著高于非吸烟者，表明miR-25-3p高表达与吸烟有关。香烟凝集物处理胰腺细胞还诱导甲基转移酶样蛋白3(METTL3)高表达，其机制是香烟凝集物引起METTL3基因启动子去甲基化，使转录因子NFIC与启动子结合，促进METTL3转录。METTL3主要功能是催化microRNA初始转录本中N6-腺嘌呤甲基化（m6A），使后者更容易被剪切复合体剪切成成熟microRNA。剪切复合体成员目前尚未完全阐明。我们运用RNA-pulldown、免疫共沉淀等方法，首次确定了RNA结合蛋白NKAP参与[m6A]pri-miR-25成熟过程。我们通过生物信息学分析及一系列生化实验，发现miR-25-3p靶基因为磷酸酶PHLPP2，miR-25-3p过表达抑制PHLPP2活性而激活下游AKT-p70S6K促癌信号。p70S6K功能之一是促进mRNA翻译成蛋白质，它被激活后可进一步增加METTL3产生，形成吸烟引起的METTL3-miR-25-3p-PHLPP2-AKT-METTL3促癌环路。研究结果表明，香烟可能通过DNA以及RNA甲基化等表观遗传改变，引起致癌的miR-25-3p因过度成熟而表达量增加，激活下游AKT-p70S6K促癌信号通路，进而在胰腺癌的发生发展中发挥重要作用。这些研究结果对阐明吸烟与胰腺癌的发生发展、建立胰腺癌早期诊断和早期干预方法具有重要意义和价值。