FAR蛋白基因在水稻干尖线虫发育和致病中的功能和作用机理以及真菌介导的RNAi方法研究

The rice white tip nematode, Aphelenchoides besseyi is one of the most important parasitic nematode on rice, with the characteristics of causing periodic disaster in rice, and has tended to intensify to harm of rice in the global in recent years. However, the mechanisms of the characteristics and trend, as well as methods to deal with this kind of situation, have not been reported yet. Our previous studies have shown that the recurrence of the rice white tip nematode disease and exacerbating harm may be associated with different pathogenic populations caused by virulence differentiation of A. besseyi in China. Fatty acid and retinoid binding protein (FAR) is a specific protein of nematodes, which is related to the development, reproduction, infection to the host, and disruption of plant defense reactions. In our previous study, the full-length cDNA of FAR gene (Ab-far-1) from A. besseyi has been obtained. Based on our previous research work, this project will carry out the research content as follows: (1) The function of Ab-far-1 gene will be analyzed using bioinformatics methods. The binding activity of purified Ab-FAR-1 protein to fatty acid and retinol will be investigated by fluorescence-based assays. (2) The Ab-FAR-1 mRNA at different development stages localized will be localized using in situ hybridization. The expression level of Ab-far-1 at different development stages and different populations will be detected by quantitative PCR (qPCR). The mechanisms of action of Ab-far-1 in developmen and pathogenesis of A. besseyi will be studied by RNAi and genetic engineering techniques. (3) Because A. besseyi can feed on many fungi such as Botrytis cinerea, a new method of B. cinerea-mediated RNAi will be studie and established. The mechanism of Ab-far-1 to control A. besseyi will be studied by using B. cinerea-mediated RNAi. On the basis of those research, we will propose a new strategy of fungi-mediated RNAi used to study functional genomics in palnt parsitic nematodes feeding on fungi, and elucidate initially the feasibility and pathways of Ab-far-1 to be used to control A. besseyi.

水稻干尖线虫病是对水稻危害最大的线虫病害之一，具有周期性成灾特点，近年在全球的发生危害呈加重趋势。但是对于这种特点和趋势的发生机制以及应对防治方法尚未有研究报道。我们前期研究表明，我国目前此病害的复发和为害加剧可能与线虫致病力分化有关。脂肪酸结合维生素A蛋白（FAR）是线虫特有的与其发育和侵染以及干扰寄主防卫反应相关的蛋白。本项目拟在前期工作基础上，对已获得的水稻干尖线虫FAR蛋白基因（Ab-far-1），通过生物信息学、qPCR、RNAi和基因工程等技术，研究其在水稻干尖线虫发育和致病中的功能；利用该线虫可以寄生灰葡萄孢菌等真菌的特性，研究灰葡萄孢菌介导的RNAi方法，并用此方法进一步研究和揭示Ab-far-1在水稻干尖线虫发育和致病中的作用机制，以及该基因在水稻干尖线虫病防治新方法研究中的应用价值，在这些研究基础上，提出真菌介导的植物线虫功能基因RNAi新策略和新技术。

水稻干尖线虫（RWTN）是危害植物地上部最严重的植物寄生线虫，与菊花叶枯线虫（CFN）等寄生植物地上部的滑刃类线虫统称为叶线虫，目前对叶线虫的发育和致病分子机制尚缺乏研究。脂肪酸结合维生素A 蛋白（FAR）是线虫特有的与其寄生和致病相关的蛋白，在植物线虫防治中具有极大的研究价值和应用潜力。本项目研究了RWTN的 FAR 蛋白基因（Ab-far-1）在线虫寄生致病中的作用，利用RWTN取食真菌的特性，研究建立真菌介导的RNAi 方法，在对RWTN和CFN的转录组进行高通量测序和分析的基础上，挖掘新的far基因，研究建立叶线虫与拟南芥互作体系和快速检测鉴定RWTN的新技术，取得以下重要结果： . （1）证实了FAR-1能够结合脂肪酸和维生素A，在幼虫、雌虫和雄虫均有表达，主要定位在真皮层和生殖腺；far-1在雌虫体内表达量显著高于其他虫态，在高致病种群的表达量显著高于低致病种群，该基因被沉默后，线虫的繁殖率和致病力显著降低。. （2）获得表达Ab-far-1 dsRNA的转基因灰葡萄孢菌，在其上培养的RWTN的Ab-far-1被有效沉默，其繁殖量和致病力被显著抑制，并且RNAi可以持续有效的传递到下一代。. （3）获得RWTN和CFN的高通量测序转录组数据，挖掘了新的发育和致病相关基因，明确了植物地上和地下部寄生线虫，在参与基因沉默代谢通路基因方面存在差异。. （4）证实了拟南芥是RWTN和CFN的新寄主，建立了利用拟南芥研究叶线虫与植物互作的模式系统。. （5）建立了RWTN LAMP检测方法，可以检测RWTN各个虫态的单一个体，可以从多种线虫混合样品和植物组织样品中直接检测出RWTN。 .本项目的研究结果，为进一步探索利用far-1防治植物线虫提供了科学依据，为可食真菌植物线虫功能基因组学研究提供了简单有效的基因沉默新方法，为研究寄生植物地上部线虫与寄主互作的分子机制提供了大量信息和新的模式系统，为RWTN检测鉴定提供了准确、快速和易行的方法，对研究建立以生物技术策略为基础的植物线虫可持续防治新途径具有重要意义。