香蕉穿孔线虫Cathepsin B 基因 的功能研究

香蕉穿孔线虫为害多种作物导致烂根病造成重大损失，近年该线虫随进口观赏植物传入我国，给我国种植业造成严重危害和威胁。我们在对传入的香蕉穿孔线虫致病性研究中，筛选和克隆到该线虫的Cathepsin B基因。Cathepsin B基因在动物寄生线虫广泛存在，与动物寄生线虫的生殖、入侵和寄生宿主等生理功能有关，因而此基因已被确定为开发防治动物寄生线虫新技术的靶标。但有关植物寄生线虫的Cathepsin B基因尚未见报道。我们对获得的香蕉穿孔线虫Capthepsin B基因的初步研究表明，其与香蕉穿孔线虫的繁殖和致病性有一定相关性，因此，本项目拟在此基础上，利用模式植物拟南芥和RNAi等技术对该线虫Capthepsin B基因功能进行研究，明确其在线虫的生殖发育、寄生和致病过程中的功能以及应用于线虫防治的潜能和价值，并建立香蕉穿孔线虫与拟南芥互作体系，为进一步研究利用该基因控制香蕉穿孔线虫奠定基础。

香蕉穿孔线虫（Radopholus similis）为害多种作物导致烂根病造成重大损失，近年该线虫随进口观赏植物传入我国，对种植业造成严重危害。我们在对传入的香蕉穿孔线虫致病性研究中，克隆到该线虫的Cathepsin B（CB）基因。CB基因在动物寄生线虫广泛存在，与动物寄生线虫的生殖、入侵和寄生宿主等生理功能有关，因而此基因已被确定为开发防治动物寄生线虫新技术的靶标。但有关植物寄生线虫的CB 基因尚未见报道。本项目通过qPCR以及dsRNA浸泡和植物介导的 RNAi 等技术，对香蕉穿孔线虫CB基因（Rs-cb-1）的功能进行了研究；另外，通过抑制差减杂交技术构建了香蕉穿孔线虫基因差异表达文库，从中筛选克隆了香蕉穿孔线虫发育和致病相关基因，取得以下重要结果：. （1）Rs-cb-1在香蕉穿孔线虫不同虫态和不同致病力种群的表达量差异明显，雌虫的表达量最高，幼虫、卵和雄虫的表达量分别比雌虫降低了60%、64%和80%，强致病力种群Rs-K的表达量是弱致病种群Rs-J的5倍。. （2）香蕉穿孔线虫经Rs-cb-1 dsRNA浸泡后，卵母细胞不能正常发育，胚胎发育历期延长了6~9d，繁殖倍数显著下降，对寄主植物的侵染致病力显著降低。. （3）通过农杆菌介导成功获得转Rs-cb-1的烟草植株，转基因烟草T2代植株对香蕉穿孔线虫的侵染表现明显的抗性。. （4）从构建的香蕉穿孔线虫SSH文库中，筛选和克隆获得香蕉穿孔线虫β-1,4-内切葡聚糖酶基因（Rs-eng-1b）与脂肪酸和维生素A结合蛋白基因（Rs-far-1），Rs-far-1是香蕉穿孔线虫新基因，Rs-eng-1b 在致病性较强种群Rs-C中的表达量是致病性较弱种群Rs-K的2.7倍，在4个虫态中的表达量差异显著，雌虫最高，幼虫、雄虫和卵分别是雌虫的30.5%、15.5% 和 10.2%，用Rs-eng-1b dsRNA液浸泡处理的香蕉穿孔线虫繁殖力和致病性均显著下降。 . 本项目明确了Rs-cb-1和Rs-eng-1b在香蕉穿孔线虫的发育、繁殖以及对寄主侵染和致病等活动中发挥重要作用，并首次通过植物介导的RNAi方法研究和证明了迁移型植物寄生线虫的基因功能，对进一步研究香蕉穿孔线虫侵染致病的分子机制和探讨利用致病相关基因建立防治植物线虫的新途径具有重要意义。.