肿瘤细胞来源自噬小体诱导调节性B细胞(Bregs)的作用及其机制研究

调节性B 细胞(Bregs)对肿瘤免疫的调节作用及机制尚不完全清楚。.申请者前期研究证实：肿瘤细胞来源的自噬小体是pAPC交叉提呈肿瘤抗原的有效载体、能诱导具有抗瘤效果的T细胞应答；近期实验发现：肿瘤细胞来源自噬小体能刺激脾脏B细胞活化并产生IL-10，胞内染色显示IL-10+B细胞细胞达6%，提示：肿瘤细胞来源自噬小体能诱导Bregs，其机制有待研究。.本项目拟以肝癌细胞为模型、探讨肿瘤细胞来源自噬小体诱导Bregs的作用及机制，研究肿瘤细胞来源自噬小体：①诱导Bregs的特性 (何前体细胞、细胞类型？)；②诱导Bregs的机制 (细胞水平：需要T细胞、MΦ或DCs协作？分子水平：识别分子BCR/TLRs？共刺激分子？)；③诱导的Bregs对肿瘤免疫的调节作用。探讨上述问题将有利于阐明肿瘤细胞来源自噬小体与B细胞的关系、为理解Bregs在肿瘤免疫耐受中的调节作用提供新思路。

第一部分 肿瘤细胞来源自噬小体诱导IL-10+Breg及其分子机制.研究发现：从肿瘤细胞培养上清可以募集到肿瘤细胞释放到胞外的自噬小体于（LC3II+ 双层膜结构，200-1000nm），TRAP在体外和体内均能刺激B细胞活化；上调MHCⅠ和Ⅱ类分子以及共刺激分子CD23、CD86、CD40的表达；分泌细胞因子IL-6和高水平IL-10，TRAP诱导IL-10+B细胞具有细胞表型为CD1d+CD5+的调节性B细胞特征。B细胞依赖其表面TLR2通过Caveolae(细胞质膜微囊)介导的细胞内吞摄取TRAP，并通过TLR2-MyD88-NF-kB信号途径活化B细胞并产生高水平IL-10。TRAP通过其蛋白质类物质、而非DNA类物质刺激B细胞活化；诱导产生IL-10+Breg主要依赖其所含有的TLR2配体—HMGB1。.第二部分 肿瘤细胞来源自噬小体诱导IL-10+Breg的免疫调节功能及其分子机制.TRAP诱导IL-10+B细胞主要通过IL-10抑制CD4+和CD8+T细胞的增殖、而不依赖细胞间相互接触，且以抗原非特异性的方式发挥抑制性功能；过继输入TRAP诱导IL-10+B细胞能以抗原非特异性方式抑制DC疫苗诱导的T细胞免疫应答及其介导的抗肿瘤作用。TRAP诱导IL-10+B细胞及其抑制T细胞增殖依赖TLR2-MyD88-NF-κB信号通路。TRAP膜结构的完整性及其携带的内源性分子佐剂—膜结合型HMGB1对TRAP诱导IL-10+B细胞的产生至关重要。.第三部分 人肿瘤细胞及患者恶性胸腹水来源自噬小体诱导IL-10+B细胞的研究.肿瘤细胞在缺氧、缺营养状态下释放的自噬小体含有更高水平的DAMP（HMGB1）。肿瘤细胞在缺氧、缺营养状态下释放的自噬小体TRAP更能有效诱导B细胞成为具有免疫抑制功能的IL-10+B细胞。收集肿瘤患者的胸腹水，采用流式细胞仪检测、WB鉴定和电子显微镜观察确定能够从肿瘤患者胸腹水中募集到自噬小体(MedAP, malignant effusions-derived autophagosomes)。不同肿瘤患者来源的人MedAP均表达HMGB1，其表达水平参差不齐，MedAP能诱导人IL-10+B细胞的产生，且与MedAP中HMGB1的含量成正相关。MedAP诱导IL-10+B细胞可抑制人CD4+和CD8+T细胞的增殖。